Papel de la esterasa diana de neuropátia (nte) y su gen codificante (pnpla6) en el desarrollo y la diferenciación celular in vitro
- Autores: David Pamies Aubalat
- Directores de la Tesis: Miguel A. Sogorb Sánchez (dir. tes.), Eugenio Vilanova Gisbert (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan María Llobet (presid.), Carmen Esteban Martínez (secret.), Antonio Francisco Hernández Jerez (voc.), Francesca Caloni (voc.), Anna Bal Price (voc.)
- Materias:
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- Resumen
- español
Papel de la esterasa diana de neuropátia (nte) y su gen codificante (pnpla6) en el desarrollo y la diferenciación celular in vitro resumen la esterasa diana de la neuropatía (nte) fue inicialmente identificada como la diana de algunos compuestos organofosforados que causan la denominada neuropatía retardada inducida por organofosforados. Algunos estudios in vivo indican que esta proteína también podría jugar una importante función en el desarrollo embrionario y por lo tanto también en la diferenciación celular. El objetivo de esta tesis es estudiar el papel de nte y de su gen codificante (pnpla6) en la diferenciación celular.
Las células madre embrionarias (esc) de ratón d3 y r1 y las células humanas embrionales tumorales derivadas de ntera2/cl.D1 (hnt2) expresaron actividad enzimática nte. Además, las células d3, hnt2 y las esc humanas h9 también expresaron el gen pnpla6 aun en su estado más indiferenciado. Las esc d3 y h9 aumentaron entre 4 y 5 veces la expresión de pnpla6 durante las primeras etapas de la diferenciación espontánea volviendo la expresión del gen al nivel de las células indiferenciadas aproximadamente en el día 5 del proceso. Sin embargo, la expresión del gen pnpla6 en células hnt2 aumentó de manera progresiva con el tiempo conforme las células se iban diferenciando a células neuronales y gliares alcanzándose un máximo de expresión de unas 200 veces el nivel de las células indiferenciadas hacia el día 35.
El silenciamiento de pnpla6 en esc d3 en diferenciación espontánea con rna silenciador (sirna) específico redujo la expresión del gen un 80% y la actividad enzimática nte un 50% a las 48 y 30 horas del tratamiento, respectivamente. Este silenciamiento también alteró la expresión de 545 genes 96 horas después de la exposición al sirna. El análisis de los procesos más alterados por el silenciamiento de pnpla6 mostró que las rutas más afectadas eran las implicadas en el desarrollo del organismo, ensamblaje celular, organización celular y desarrollo del sistema nervioso. Estos análisis también sugirieron que pnpla6 podría tener un papel relevante en la homeostasis de los lípidos y la vasculogénesis.
El silenciamiento de pnpla6 en hnt2 en diferenciación dirigida a neuroectodermo redujo la expresión del gen un 97% y la actividad enzimática nte un 60% a las 24 y 96 horas del tratamiento con el sirna, respectivamente. En estos mismos puntos de la diferenciación (días 1 y 4 del proceso) el número de genes alterados por el silenciamiento fue de 28 y 394, respectivamente. Las rutas funcionales alteradas estuvieron relacionadas con la formación de epitelio, la neurogénesis, y los procesos del desarrollo. Además, el número de neuronas encontrado en cultivos de células hnt2 silenciadas tras 13 días de neurodiferenciación disminuyó un 80% con respecto al de los cultivos control, encontrándose además grandes alteraciones morfológicas en células nerviosas maduras tras 66 días de diferenciación. La inhibición crónica de nte por el organofosforado neuropático mipafox en células hnt2 en neurodiferenciación no causó alteraciones genotípicas ni fenotípicas destacables.
En conclusión, se ha demostrado que nte y pnpla6 están implicados en la diferenciación y el desarrollo embrionario al ser imprescindibles para la formación del sistema nervioso, vascular y el desarrollo de la placenta.
- English
Role of neuropathy target esterase and its encoding gene (pnpla6) in in vitro cell development and differentiation abstract neuropathy target esterase (nte) was initially identified as the target of some organophosphorus compounds which cause the so-called organophosphorus-induced delayed neuropathy. Some in vivo studies indicate that this protein could also perform an important function in embryonic development and, therefore, in cell differentiation. This thesis aims to study the role of nte and the gene encoding it, pnpla6, in cell differentiation.
D3 and r1 mouse embryonic stem cells (escs) and human embryonic tumour cells derived from ntera2/cl.D1 (hnt2) expressed nte enzymatic activity. Furthermore, d3 and hnt2 cells and human h9 escs also expressed gene pnpla6, even in its more undifferentiated state. D3 and h9 escs increased the pnpla6 expression by 4-5 times during early spontaneous differentiation stages, and the gene expression returned to the undifferentiated cells¿ level on around day 5 of the process. Nonetheless, the pnpla6 gene expression in hnt2 cells progressively increased with time as cells differentiated to neuronal and glial cells to reach a maximum expression, which was towards day 35 about 200 times higher than the undifferentiated cells¿ level.
Pnpla6 silencing in d3 escs during spontaneous differentiation with specific silencing rna (sirna) lowered the gene expression by 80% and nte enzymatic activity by 50% after 48 h and 30 h of treatment, respectively. This silencing also altered the expression of 545 genes at 96 h after sirna exposure. The analyses of the most altered processes after pnpla6 silencing showed that the most affected pathways were those implied in organism development, cell assembly, cell organization and nervous system development, and suggest that pnpla6 could play an important role in lipid homeostasis and in vasculogenesis.
Pnpla6 silencing in hnt2 during differentiation directed towards the neuroectoderm lowered the gene expression by 97% and nte enzymatic activity by 60% at 24 h and 96 h of sirna treatment, respectively. At these same differentiation points (days 1 and 4 of the process), 28 and 394 genes were altered by silencing, respectively. Altered functional pathways were related with epithelium formation, neurogenesis and development processes. Moreover, the number of neurons found in the silenced hnt2 cells cultures after 13 days of neurodifferentiation dropped by 80% if compared with control cultures, and major morphological alterations were observed in mature nerve cells after 66 days of differentiation.
Chronic nte inhibition by neuropathic organophosphorus mipafox in hnt2 cells during neurodifferentiation caused no important genotypic or phenotypic alterations.
To conclude, it has been demonstrated that nte and pnpla6 are implicated in differentiation and embryonic development as they are essential for nervous and vascular systems formation and for placenta development.
- español
