Transferencia electrónica directa a citocromo c inmovilizado sobre electrodos modificados. Aplicación en sensores amperométricos
- Autores: Sara López-Bernabéu
- Directores de la Tesis: Francisco Montilla Jiménez (dir. tes.), Emilia Morallón (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat d'Alacant / Universidad de Alicante ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: C. R. Mateo (presid.), Francisco J. Huerta (secret.), M. Angélica del Valle (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencia de Materiales por la Universidad de Alicante
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: RUA
- Resumen
Los materiales son un elemento clave a la hora de definir el desarrollo de la sociedad y la innovación industrial. Existe un tipo de materiales emergentes conocidos como materiales avanzados que están basados en conocimiento, esto es, proporcionan nuevas funcionalidades y mejores rendimientos, y son indispensables para el desarrollo sostenible y la competitividad industrial.1,2 El desarrollo de productos con nuevas aplicaciones a menudo implica el diseño de materiales completamente novedosos con capacidad de ofrecer los rendimientos adecuados durante su tiempo de vida. Estos materiales son la base para el progreso en diferentes áreas como las tecnologías de la salud, seguridad del ciudadano, medio ambiente y electrónica.1,3,2 Por tanto, es necesario seleccionar la estrategia más adecuada para la biofuncionalización de estos materiales.
Investigaciones recientes en el campo de la nanotecnología han sentado las bases en el desarrollo de sensores electroquímicos.4 Éstos son dispositivos analíticos que convierten la energía química de un determinado analito en una señal eléctrica, proporcional y medible, sobre la superficie de un electrodo de trabajo. Por tanto, son capaces de detectar la presencia y cuantificar un determinado analito con una gran sensibilidad, exactitud y precisión.5–7 Sin embargo, cuando el analito forma parte de una mezcla compleja (como los fluidos biológicos), la selectividad en electrodos convencionales (Pt, Au, carbón vítreo, Hg, etc.) se ve comprometida debido a que las especies pueden reaccionar electroquímicamente al aplicar potenciales próximos.
Con el fin de subsanar este inconveniente se han empleado los biosensores electroquímicos, los cuales incorporan un material bioactivo responsable del reconocimiento selectivo del analito. Además, al entrar en contacto íntimo con un transductor apropiado, es posible convertir los cambios químicos ocurridos en la etapa de reconocimiento en señales eléctricas proporcionales que puedan ser transferidas a la superficie del electrodo para su medida e interpreptación.8,9 En este contexto, el empleo de técnicas electroquímicas y espectroscópicas es muy relevante para la fabricación, desarrollo y caracterización de estos dispositivos biosensores. Centrándonos en el mecanismo de transducción y la transferencia de electrones entre el centro activo de la proteína y la superficie del electrodo, los biosensores se clasifican en tres generaciones: primera, segunda y tercera. En los biosensores de tercera generación la transferencia de carga se produce de manera directa desde la proteína al electrodo.10,11 Estos dispositivos presentan mejor especificidad y sensibilidad que los que emplean mediadores redox entre la proteína y el electrodo (segunda generación) o los que detectan y cuantifican un producto o cofactor de la reacción enzimática (primera generación). Por tanto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral es desarrollar un dispositivo biosensor de tercera generación.
El mayor problema que existe actualmente para el desarrollo de estos dispositivos es la dificultad que muestran las proteínas redox en transferir carga desde sus sitios activos hasta la superficie del electrodo, de modo que la probabilidad de transferir carga es muy baja. Esto puede ser debido a su esqueleto peptídico que dificulta que el centro activo se oriente adecuadamente para la transferencia de carga electrónica.
Dado que se ha de producir una transferencia electrónica adecuada entre el bioelemento y la superficie del electrodo, es importante comprender la manera de inmovilizar la proteína sobre un electrodo soporte. De esta forma, factores como la orientación de la biomolécula; la distancia del centro redox a la superficie electródica; y la desnaturalización de la proteína son claves para desarrollar un sistema adecuado basado en una proteína inmovilizada.
El citocromo c (cyt c) es la proteína redox elegida como proteína modelo. Se encuentra entre las proteínas más estudiadas debido a su pequeño tamaño (Mw = 12 384 Da) y estructura sencilla. Se trata de una hemoproteína globular, soluble en agua que presenta un color rojizo en disolución, y cuyas propiedades físicas y químicas resultan interesantes en el estudio electroquímico en diferentes electrodos.12 En la presente Tesis Doctoral se han estudiado dos formas principales para optimizar la transducción. Ambas consisten en utilizar un polímero conductor, el poli(3,4-etilendioxitiofeno (PEDOT), que sea capaz de conectar el centro activo de la proteína con la superficie del electrodo permitiendo así la transferencia de carga eléctrica.
La primera está basada en modificar un electrodo convencional de Au depositando de forma electroquímica el polímero conductor PEDOT y analizar la transferencia redox producida entre la proteína cyt c, disuelta en un medio tamponado a pH 7, y la superficie del electrodo modificado.13 La segunda metodología se ha basado en la inmovilización de la proteína cyt c en una matriz de sílice en condiciones suaves de presión y temperatura mediante el método sol-gel. Dentro de la matriz sol-gel, la proteína se encuentra en su estado nativo y preserva su actividad.14 Además, es posible modificar los precursores de la sílice obteniendo mejor respuesta electroquímica del cyt c encapsulado.15 Por otro lado, dado el carácter dieléctrico de la matriz de sílice es imprescindible introducir materiales conductores que transporten la carga eléctrica hasta la superficie del electrodo.16 El polímero conductor PEDOT se ha utilizado ampliamente en películas finas por su carácter electrónico, interesantes propiedades ópticas y su fácil síntesis.17,18 En este trabajo se ha estudiado el mecanismo de transferencia electrónica ente el PEDOT y la proteína cyt c encapsulada en la matriz de sílice con el objetivo de mejorar el proceso de transducción entre el centro activo de la proteína y la superficie del electrodo,19 y así desarrollar un material funcional aplicable en el campo de los biosensores electroquímicos.
Además, se ha estudiado la aplicación de este dispositivo biosensor formado por la proteína encapsulada en la matriz de sílice funcionalizada, analizando el proceso de reducción de peróxido de hidrógeno (H2O2).
Las conclusiones generales de esta Tesis Doctoral son: Se han sintetizado electrodos funcionalizados electroquímicamente con el polímero conductor poli(3,4-etilendioxitiofeno:poli(4-estirensulfonato) (PEDOT:PSS).
El polímero PEDOT:PSS presenta su estado dopado (conductor) en una ventana de potencial comprendida entre 0.2 – 1.2 V.
La posición en las bandas vibracionales del PEDOT:PSS es independiente del potencial aplicado.
Al aplicar un potencial de oxidación se observa una activación de los modos vibracionales propios del estado oxidado del polímero, sin haber una degradación del material.
Dado que se ha analizado la composición elemental de PEDOT:PSS, éste se compone mayoritariamente de S proveniente del polielectrolito aniónico PSS, y por tanto, la superficie del electrodo modificado PEDOT:PSS se presenta cargada negativamente.
Electrodos modificados con PEDOT:PSS son capaces de promocionar carga electrónica a la proteína citocromo c (cyt c).
Electrodos funcionalizados con PEDOT:PSS presentan una velocidad de transferencia electrónica de dos órdenes de magnitud mayor a la obtenida empleando electrodos convencionales o modificados con SAMs.
Considerando la baja accesibilidad del centro redox activo a la superficie del electrodo, las modificaciones de PEDOT:PSS inducen cambios en la orientación de la proteína.
Durante la oxidación de citocromo c los residuos de lisina (Lys) interaccionan de forma electrostática con la superficie cargada negativamente, orientando el grupo hemo perpendicular a la superficie del electrodo.
Se ha inmovilizado la proteína citocromo c en un electrodo basado en una matriz de sílice funcionalizada con grupos metilo mediante el método sol-gel.
La relación entre la cantidad de proteína inmovilizada y la densidad de corriente lleva a que solamente un 2 % de la proteína es electroactiva.
La inserción electroquímica de polímero conductor PEDOT:PSS a través de los poros de la matriz de sílice sirve para conectar eléctricamente las moléculas de citocromo c que han quedado aisladas de la superficie del electrodo.
Cantidades moderadas de PEDOT:PSS comprendidas entre 1.3 – 7.2 µg cm-2 presentan una buena respuesta de transferencia electrónica.
La presencia de polímero PEDOT:PSS en la sílice con el cyt c inmovilizado produce una mejora de hasta 3 veces superior en el proceso de reducción de la proteína.
Se ha empleado el sistema proteína inmovilizada en la matriz de sílice en la detección de peróxido de hidrógeno (H2O2) para desarrollar un biosensor electroquímico de tercera generación.
La proteína incluida en la matriz de sílice presenta buenas propiedades electrocatalíticas para la reducción de H2O2, obteniéndose una relación lineal entre la sensibilidad del proceso y la concentración de citocromo c.
Un intervalo comprendido entre 0.4 – 4.0 µg cm-2 PEDOT:PSS produce una buena transferencia electrónica polímero-proteína durante la reducción de H2O2.
