Celulas madre mesenquimales y un biomaterial bifasico como aplicación en terapia celular para la regeneración del cartílago articular de rodilla
- Autores: Jose Maria Lopez Puerta Gonzalez
- Directores de la Tesis: José Antonio Andrades Gómez (dir. tes.), Andrés Carranza Bencano (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Becerra Ratia (presid.), Pedro Infante Cossío (secret.), Antonio Jiménez García (voc.), José M. Soria López (voc.), Mariano Andrés García Arranz (voc.)
- Programa de doctorado: ACTUALIZACIONES EN CIRUGIA
- Materias:
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- Resumen
El cartílago hialino articular es un tejido con una muy limitada capacidad de autoregeneración, debido a su naturaleza avascular, aneural, alta complejidad de su matriz extracelular (MEC) y baja proliferación de sus células. Además, se trata de un tejido especializado altamente estratificado tanto celular, bioquímica como biomecánicamente. Por ello, la reparación espontánea de las lesiones osteocondrales siempre cursan con la formación de un tejido fibrocartilaginoso, inadecuado. A pesar de que los tratamientos actuales son prometedores, todavía no se ha encontrado ningún procedimiento que pueda producir una regeneración satisfactoria del cartílago hialino y del hueso subcondral. Desde el punto de vista de la ingeniería tisular y la medicina regenerativa, es crítico utilizar la fuente celular adecuada para llevar a cabo una terapia celular condroregeneradora eficaz. En consecuencia, y basándonos en los resultados recientes de nuestro grupo utilizando células madre mesenquimales (MSCs) adultas, hemos desarrollado un producto celular autólogo, formado por MSCs indiferenciadas susceptibles de diferenciación condrogénica, que permite la regeneración tisular y funcional del cartílago hialino articular, utilizando un biomaterial colagénico, en un modelo de lesión osteocondral de rodilla en conejo.
Introducción El cartílago es un tejido conectivo altamente especializado, formado por células, principalmente condroblastos/condrocitos, y fibras, mayoritariamente colágeno; todo ello embebido en una matriz extracelular (MEC) amorfa, viscosa, de aspecto gel, y con una alta complejidad bioquímica, estructural y biomecánica (Buckwalter y col., 1998; Johnson, 2001).
El cartílago articular (CA) proporciona a los huesos sobre los que se dispone un superficie elástica y resistente, a la vez que protege a la articulación repartiendo la presión (compresión) de carga a la que es sometida. Al mismo tiempo, junto con el líquido sinovial, proporciona un coeficiente de baja fricción que permite el movimiento libre de la propia articulación (Aigner, 2003). Las fibras colagénicas que constituyen la MEC de este cartílago son predominantemente de tipo II, acompañadas por proteoglucanos, responsables (específicamente el agrecano) del alto grado de hidratación de su matriz gracias a su capacidad para retener agua, en torno a un 75%, debido a su naturaleza electrostática negativa. En relación al componente celular, los condrocitos son células predominantemente redondeadas, originadas a partir de células madre mesenquimales (MSCs), procedentes de la médula ósea (MO) localizada en cavidades de la matriz (Lin y col., 2006), y representan un 5-10% del volumen de la fase sólida del cartílago. Los condrocitos son esenciales en el mantenimiento de la MEC, regulando tanto la secreción de sus componentes como la degradación/remodelación de la misma (Hunziker, 2002). Estructuralmente, el CA se divide en 3 zonas diferentes: la superficial (ZS), la media (ZM), y la profunda (ZP). Estas regiones, con funciones específicas diferentes, se identifican por la composición de la MEC, su biosíntesis, la expressión génica y morfología de sus células, así como por las distintas propiedades biomecánicas de las mismas (Schinagl y col., 1997; Darling y col., 2004; Shieh y col., 2006). La gran mayoría de las lesiones condrales descritas ocurren en la ZS del cartílago. En ella, existe un proteoglucano de unos 345 kDa, llamado proteína de la zona superficial (superficial zone protein, SZP), de función lubricante durante el movimiento de la articulación, por lo que comúnmente se la conoce también por el nombre de lubricina (Jay y col., 2001), con quien comparte homología y es codificada por el gen Prg4 (Ikegawa y col., 2000). Es sintetizada, y secretada al líquido sinovial, exclusivamente por los condrocitos de la ZS y por las células sinoviales de la articulación (Schumacher y col., 1994; Niikura y col., 2007). La pérdida de la SZP está asociada con la enfermedad de la osteoartritis (OA), en la que puede observarse un disminución local de la proteína ya desde los primeros síntomas (Young y col., 2006), por lo que la presencia de dicho proteoglucano está considerado como crítica para el mantenimiento de la función y la homeostasis de la articulación (DuRaine y col., 2009).
Desde el punto de vista clínico, el CA presenta una limitada capacidad de regeneración, debido a: 1) su naturaleza avascular, por lo que está desprovisto de una fuente disponible de células madre circulantes (células condroprogenitoras; Martin y col., 2005) y de los factores humorales correspondientes; 2) su naturaleza aneural, con la consiguiente carencia de inervación; y 3) la alta complejidad de su MEC que, en un eventual proceso de reparación, no recapitula su propio desarrollo y morfogénesis. Dependiendo de la profundidad del daño, existen 3 tipos de lesiones que afectan al CA: i) microtrauma, fractura condral y fractura osteocondral. En cualquiera de dichas situaciones puede encuadrarse la OA, la forma más común de artritis, una enfermedad muy dolorosa, de una altísima prevalencia en la sociedad (24 millones de adultos en EEUU; Singh y col., 2002), que no necesariamente es una consecuencia de la edad, y que afecta directamente al CA por alteración de su integridad, limitando la movilidad de la articulación (Nakamura y col., 2009). La etiología de la OA es desconocida y se manifiesta en cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares de las células y de la MEC del cartílago hialino (Christensen y col., 2005).
Actualmente, la solución clínica de las lesiones condrales supone un reto para los clínicos y científicos. La reparación es el proceso rápido para resolver una lesión, pero el tejido reparativo no es idéntico al tejido original, pudiendo existir incluso una falta de integración con el mismo. La regeneración, en cambio, es un proceso relativamente lento que recapitula el desarrollo y la morfogénesis del tejido a tratar, restaurando completamente la estructura y función del mismo, incluyendo una adecuada integración con el tejido original. A pesar de que los tratamientos de los últimos años son prometedores, todavía no se ha encontrado ningún procedimiento que pueda producir una reparación (regeneración) satisfactoria del cartílago hialino y el hueso subcondral. Teniendo en cuenta la capacidad de la célula cartilaginosa para nutrirse por difusión de la MEC y por imbibición sinovial, recientemente, desde los trabajos pioneros de Heatley y col. (1980), se han desarrollado procedimientos quirúrgicos para tratar de reparar los defectos osteocondrales, o para al menos proporcionar un alivio sintomático. El objetivo es prevenir la extensión de las lesiones e inducir la regeneración del cartílago, o al menos retrasar la progresión a OA, o la necesidad de reemplazamiento articular. Estas técnicas se dividen en 4 categorías: a) tratamiento sintomático, b) estimulación de células derivadas de la MO, c) condrogénesis con células o tejidos trasplantados, y d) trasplantes de cilindros osteocondrales. La microfractura (b), que provoca la afloración de MO por perforación del hueso subcondral (Buckwalter y col., 1998); o la mosaicoplastia (d), ya sea heteróloga o autóloga, que transfiere cilindros de cartílago hialino procedente de tejido sano, bien de zonas de menos carga próximas a la lesión, o de otra articulación (Hunziker y col., 2006), acaban provocando la formación de fibrocartílago como tejido cicatricial, el cual se muestra inviable para devolver las características propias del CA a largo plazo, representando además, con el paso de los años del paciente, lugares de fácil fractura y nuevas lesiones (Buckwalter y col., 2004), al margen de problemas para obtener suficiente superficie de cartílago a trasplantar y de dañar un área para reparar otra. En el caso de c), técnica muy extendida en la clínica, se está actuando con trasplante de condrocitos autólogos, ya sea en ausencia de transportador (autologous chondrocytes implantation, ACI), o vehiculizados en una membrana (MACI), casi siempre de colágeno. En este sentido, los trabajos de Couceiro y col.
(2002) se están centrando en la obtención de cultivos celulares de condrocitos y su implantación in situ, aunque este procedimiento está planteando problemas de falta de prendimiento del implante a la lesión a medio plazo. En ningún caso, y hasta el momento, se indica que el ACI/MACI sean superior a otras alternativas terapéuticas en el tratamiento de las lesiones condrales de rodilla; más bien al contrario, por tratarse de un procedimiento altamente invasivo y relativamente costoso, ya que necesita de dos intervenciones quirúrgicas. Por tanto, en la actualidad, no existen criterios claros acerca de cuál de estas alternativas es la más adecuada para el tratamiento de las lesiones del CA.
Con todo ello, y en consecuencia, la ingeniería tisular tiene actualmente el reto potencial de resolver el problema clínico de la regeneración del CA, estimulando el crecimiento de suficiente cartílago nuevo en el lugar de la lesión, e impedir la pérdida posterior del mismo (Hollander y col., 2006). No parece probable que la sola aplicación in situ de agentes químicos osteoinductores, como las proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs) (Samartzis y col., 2005), o los factores de crecimiento plaquetarios (Lettice y col., 1999), sea el paso definitivo que se esperaba. En primer lugar, porque ninguna BMP en particular es la panacea del proceso condroosteogénico, ya que, probablemente, sea al menos una docena de éstas moléculas diferentes las que actúen en el proceso de manera concatenada (Wan y col., 2005). Y, en segundo lugar, porque la aplicación indiscriminada de estas citoquinas, a dosis varios órdenes de magnitud por encima de la fisiológica y a merced de la circulación sistémica, podría desarrollar cualquiera de sus diversos efectos, a veces indeseados, como puede esperarse de moléculas de acción pleiotrópica. Las BMPs son mediadores químicos muy importantes que actúan sobre las células para que éstas, y sólo ellas, realicen la regeneración deseada. Utilizar mediadores químicos sin células efectoras, con células insuficientes o incapaces, es desaprovechar recursos costosos en cada acto quirúrgico. Se impone, pues, una aceptación prudente del uso directo de estos agentes, a la vez que debe recomendarse un estudio más profundo, y un mejor desarrollo de sistemas de liberación controlada, que permitan un perfil de cesión óptimo en cada caso y para cada factor (Richardson y col., 2001).
Las células son los efectores únicos e insustituibles de la esqueletogénesis. Su número y biología sufren cambios significativos con la edad y la enfermedad, que pueden ser corregidos mediante acción directa, induciendo su proliferación, migración y diferenciación in situ, o indirectamente, realizando esos procesos ex vivo, aprovechando los conocimientos que nos proporcionan las células troncales (SC) y la terapia celular. Las especiales características de los tejidos esqueléticos, donde la MEC, como hemos dicho, alcanza especial relevancia, hace que la vehiculización de células y moléculas a su través permita la condroosteoconducción y condroosteoinducción de la forma deseada. El desarrollo de los materiales condroosteoconductores, realzado por los avances que permiten la conquista de magnitudes nanométricas, presenta un panorama de cambios significativos en la clínica ortopédica.
En estos momentos, se está extendiendo la estrategia experimental que trata de buscar MSCs susceptibles de diferenciarse hacia condroblastos (Kuroda y col., 2007), las cuales pueden aislarse a partir de tejidos adultos, tales como MO (Johnstone y col., 1998), músculo esquelético (Kuroda y col., 2006), grasa (Lee y col., 2008) y sinovia (Mochizuki y col., 2006). Las MSCs representan un atractivo para la medicina regenerativa del cartílago, porque se pueden obtener con una mínima morbilidad, aislar/expandir fácilmente en cultivo y son multipotentes, incluyendo la vía condrogénica (Yoshimura y col., 2007). Sobre la base de nuestra experiencia de los últimos años con este tipo celular, creemos que el implante en el ambiente articular de células en vías de diferenciación condrogénica puede ser un procedimiento que permita la formación de cartílago de manera más natural y, por tanto, que el nuevo tejido se forme de novo integrado en el que se pretende tratar, haciendo la regeneración estable, duradera y funcional. Es decir, proponemos una regeneración intratisular más que una reparación de la lesión. A pesar de estos datos, actualmente no existe todavía un criterio único a la hora de proponer la terapia celular más adecuada, con una clarificación de los procedimientos, parámetros y condiciones a fin de seleccionar la fuente celular ideal.
En esta investigación, por tanto, hemos preparado in vitro un producto eficaz de terapia celular con MSCs adultas autólogas, utilizando para su implante in vivo un biomaterial colagénico, con una organización fibrilar novedosa en forma de membrana bifásica, para el implante celular en lesión de rodilla de conejo. Los resultados positivos obtenidos en este estudio avanzan en la aplicación clínica de una terapia celular basada en MSCs para el tratamiento de las lesiones del CA.
Metodología Procesamiento in vitro: obtención y preparación de las células Los experimentos se realizaron utilizando 40 conejos de la variedad New Zealand, de unos 3 kg de peso, de acuerdo a los procedimientos del Comité Ético de la Universidad de Málaga sobre el trato de animales de experimentación. La obtención de los tejidos, así como las operaciones de trasplante, se llevaron a cabo bajo analgesia/anestesia con buprenorfina/ketamina/xilacina (0.05 mg/kg, +25-35 mg/kg, +5-10 mg/kg, intramuscular). En el caso de los implantes, una rodilla actuó como control de la otra.
La médula ósea (MO) se obtuvo por punción y aspirado en la cresta ilíaca utilizando un abocath y aguja de 18G, en torno a 4 ml en presencia de 1 ml de heparina. Las células obtenidas se lavaron 2 veces en medio de cultivo no suplementado, se centrifugaron y el pelet se resuspendió con medio de cultivo completo (DMEM, 10% FCS, 1.5% de L-glutamina, 1% P/S y 0.5% anfotericina B) y se cultivaron en frascos FT75 (Nalge Nunc Int., EEUU) bajo condiciones estándar. A los 4 días se realiza el primer cambio de medio para eliminar las células no adheridas, y a partir de aquí, los cambios de medio se realizan cada 3 días hasta un total de 14 días a pase de cultivo 0 (p0). A continuación, las células se tripsinizan, recuentan y resiembran a pase 1 (p1) de cultivo en placas de cultivo de 60 cm2, a una densidad de 10, 50 y 100 células/cm2. En este momento, se guardan varios viales congelados para posterior estudio, utilizando DMSO al 5% en medio completo y una densidad de 1x106 células/ml. Tras otros 7 y 14 días de cultivo, se recogen las células de tres pocillos de cada densidad celular y se cuentan en un hemocitómetro, a fin de calcular la tasa de crecimiento. Aprovechando el amplio panel de anticuerpos anti-CD disponibles en nuestro laboratorio, se realiza citometría de flujo rutinaria para certificar el perfil fenotípico de las células obtenidas, debiendo constatar, al menos, los siguientes: positivas a CD13, CD29, CD44, CD71, CD90, CD105, CD271 y Stro1; y negativas a CD34 y CD45 (Miltenyi Biotec, Alemania).
Para inducir la diferenciación condrogénica se llevan 250.000 células en pase 1 (p1) de cultivo a un tubo de propileno de 15 ml (Becton Dickinson) y se centrifugan a 450 g durante 10 minutos. Los pelets resultantes se cultivan 12 días en medio condroinductor, compuesto de DMEM con 10 ng/ml TGF-beta1 (R&D Systems), 100 nM dexametasona, 50 microgramos/ml ácido ascórbico, 100 microgramos/ml piruvato sódico, 40 microgramos/ml prolina (Sigma, EEUU), e ITS-plus (6.25 microgramos/ml insulina bovina, 6.25 microgramos/ml transferrina, 6.25 microgramos/ml ácido selénico, 5.35 microgramos/ml ácido linoléico, 1.25 microgramos/ml albúmina de suero bovino; Collaborative Biomedical Products). A fin de evaluar la diferenciación condrogénica, para el análisis microscópico, los pelets se procesan en parafina para histología convencional y se tiñen con azul alciano, e immunohistoquímica frente a colágenos I, II y X. Además, se realiza RT-PCR (colágenos I, II y X, Sox9 y agrecano).
Procesamiento in vivo: implante Tras la analgesia/anestesia de los animales, según se indicó anteriormente, realizamos el rasurado de las dos rodillas y la desinfección del campo quirúrgico. Abordamos la articulación por incisión parapatelar medial y rechazo de la rótula hacia externo, para luego provocar una lesión osteocondral en el cóndilo femoral en zona de carga, con un trocar de 3x3 mm (lesiones de este tamaño excluyen la reparación espontánea). Se lava el defecto con suero fisiológico y en la rodilla derecha (situación experimental) se implanta la membrana colagénica adsorbida por vacío con 2x106 de MSCs obtenidas anteriormente. El transportador celular tiene unas dimensiones de 2x2x1 mm y está formado por fibras de colágeno I y III dispuestas de tal forma que, en la cara superior (cara al espacio sinovial), aparecen entrelazadas de forma más tupida, y en la inferior (cara a las paredes y suelo de la lesión osteocondral) más laxas, dejando un espacio medio de 250 micras, donde el 83% de las células adsorbidas anidan. Este biomaterial es comercial (Chondro-Gide®, Geistlich Pharma, Suiza) y está siendo utilizado ampliamente en cirugía clínica de rodilla. El implante se realiza por pre-fit, con lo que evitamos utilizar ningún tipo de pegamento o sutura, eliminando así cualquier tipo de interferencia en el estudio, reducimos la morbilidad y el tiempo de intervención. La rodilla izquierda (situación control) se implanta con la membrana sin células y se interviene de la misma forma. Finalmente, se suturan ambas heridas y se suministra al animal analgésico/antibiótico (15 mg/kg subcutáneo) durante 5 días en post-operatorio. Los conejos se sacrifican por sobredosis de pentobarbital sódico a las 4, 12, y 24 semanas, a fin de evaluar los resultados de la regeneración, mediante un examen macroscópico e histológico de la lesión, siguiendo los parámetros habituales (evaluación de Wakitani).
Resultados Los resultados de esta investigación nos han procurado en la lesión condro-osteoarticular un tejido de regeneración igual al cartílago adyacente en los tres estratos cartilaginosos y al hueso subcondral, tanto en organización/disposición de sus células como en cantidad/calidad de la matriz cartilaginosa/ósea circundante, que se integra de manera permanente con el tejido receptor, y que, además, es funcional desde el punto de vista de su respuesta a las fuerzas de carga habituales en esa zona concreta de la rodilla.
La presente invención está destinada a proporcionar, en el ámbito de la Cirugía Ortopédica y Traumatología, la aplicación de este producto y esta metodología para la regeneración del cartílago hialino articular, por medio de condro/osteogénesis terapéutica, en pacientes afectos de lesiones osteocondrales que, en mayor o menor superficie, puedan desencadenar en osteoartritis localizadas y áreas de osteocondritis.
De esta forma, podremos desarrollar una estrategia regenerativa consistente en la aplicación de células tronco mesenquimáticas, capacitadas ex vivo hacia el linaje condro/osteogénico, aplicable a patologías necesitadas de condro/osteogénesis, para mejorar situaciones regenerativas osteocondrales que no están resueltas con los métodos tradicionales. Podremos generar igualmente criterios de diseño de implantes quirúrgicos, biológicamente inactivos, que se adapten a las necesidades generadas por el empleo de terapia celular en la clínica humana. Estos criterios de diseño podrían ser transferidos a la industria.
