Caracterización de arqueas halófilas basada en el estudio de la composición de lípidos polares y otros métodos taxonómicos
- Autores: Paulina Corral Villa
- Directores de la Tesis: Antonio Ventosa Ucero (dir. tes.), María del Carmen Gutiérrez Navarro (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan José Borrego García (presid.), Cristina Sánchez-Porro Álvarez (secret.), José Luis Copa Patiño (voc.), Victoria Béjar Luque (voc.), Robertson Thane Papke (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
El presente proyecto de Tesis Doctoral se enmarca en la investigación realizada previamente bajo el proyecto "Multigenome Access technology for Industrial Catalysts" (MGATech), financiado por la Comisión Europea durante el período 2003-2007. Dentro del citado proyecto se estudió en concreto la biodiversidad haloarqueas de una serie de lagos hipersalinos localizados en Mongolia Interior (China) que no habían sido microbiológicamente estudiados con anterioridad; por ello una parte de este proyecto es complementario a los estudios realizados previamente por parte de nuestro grupo de investigación. Se realizó así la descripción de nuevas cepas de haloarqueas tanto neutrófilas como alcalófilas aisladas de Lagos de Mongolia interior en China, completando así el estudio previo de éstos ambientes. Posteriormente se estudiaron muestras de la Región Autónoma del Tíbet, que no habían sido estudiadas con anterioridad y que fueron tomadas en Junio del 2004 bajo el mismo proyecto.
Por otro lado, la mayor parte de los estudios realizados en esta tesis se engloban bajo el proyecto suscrito con la Universidad de Connecticut: "Towar comprehending Prokaryotic Species Using Halorubrum sp. as a Model" (2009-2013) financiado por la NSF (National Science Foundation) durante el cual se realizaron varios estudios en base a un grupo de cepas aisladas pertenecientes al género Halorubrum, con el propósito de establecer comparaciones entre estudios los filogenéticos basadas en la secuenciación del gen ARNr 16S con estudios realizados por secuenciación multilócica (MLSA), los resultados obtenidos de ambos, junto al análisis de la composición de lípidos polares y estudios de hibridación ADN-ADN permiten perfilar la taxonomía halobacterial.
Con el fin de conocer la influencia biogeográfica en las poblaciones de arqueas, se estudiaron diversos ambientes hipersalinos procedentes de zonas geográficamente dispersas: Lago Erliannor, Shangmatala y Chagannor de la Mongolia Interior, Lago Bange en la región autónoma del Tíbet, Aran-Bidgol en Irán y las Salinas de Isla Cristina en Huelva-España.
En la actualidad, la clasificación de las haloarqueas se basa en un enfoque polifásico, que integra la caracterización fenotípica, genotípica y quimiotaxonómica. Los métodos estándar mínimos para la clasificación de nuevos taxones del orden Halobacteriales, son los únicos validados hasta el momento considerando un nuevo taxón si se cumplen rigurosamente con los parámetros establecidos.
El marcador filogenético que se utiliza en la clasificación procariota, está basado fundamentalmente en el análisis de la secuencia del gen ARNr 16S, a pesar de que se ha comprobado que tiene limitaciones, no siendo idóneo para estudiar la taxonomía de algunos grupos taxonómicos como es el género Halorubrum, ya que a la hora de ser clasificados y diferenciados correctamente presentan dificultades. Los dos principales inconvenientes son: la baja tasa de evolución (no permite discriminar correctamente entre especies distintas) y la posibilidad de diversas especies procariotas de tener dos o más copias del operón del ARNr (Acinas y col., 2004; López-López y col., 2007) como sucede también en los géneros Haloarcula y Halomicrobium.
Durante los últimos años se han realizado estudios utilizando otros marcadores filogenéticos alternativos denominados housekeeping genes con el fin de confirmar los datos aportados por el ARNr 16S para analizar su capacidad de distinguir entre especies próximas filogenéticamente, de esta manera establecer una clasificación natural basada en la filogenia de los microorganismos. Una de las aproximaciones empleadas es el análisis por secuenciación multilócica (Multilocus Sequence Analysis, MLSA), este análisis consiste en el estudio de la secuencia concatenada de varios genes esenciales (un mínimo de cinco) con el objetivo de medir la semejanza genómica entre microorganismos y resolver con mayor sensibilidad la estructura genealógica del taxón.
Debido al elevado número de especies pertenecientes al género Halorubrum que se aíslan con frecuencia de ambientes hipersalinos, consideramos que este género es un buen modelo dentro de las haloarqueas neutrófilas y alcalófilas para realizar un estudio del perfil de lípidos polares, así como el estudio de MLSA y comprobar su utilidad en este grupo taxonómico. Por ello, en este estudio pretendemos comprobar si el gen ARNr 16S es adecuado para clasificar las arqueas de un grupo de cepas del género Halorubrum aisladas del lago Aran Bidgol en Irán, o si por el contrario esta clasificación debe ser completada y readaptada a los resultados obtenidos del estudio de MLSA, estudios de hibridación ADN-ADN y las características de los perfiles de lípidos polares de las cepas. En el presente trabajo se ha realizado un estudio de la biodiversidad cultivable de haloarqueas de ambientes hipersalinos de diversos hábitats separados geográficamente, mediante el empleo de técnicas de cultivo tradicionales y el diseño de medios de cultivo que permitieron el aislamiento y caracterización de nuevas haloarqueas alcalófilas y alcalotolerantes en óptimas condiciones. Los estudios filogenético se basaron en la secuenciación del gen que codifica el ARNr 16S, incluyéndose además resultados de estudios de MLSA para las cepas de Haloruburm del lago Aran Bidgol así como un análisis detallado de lípidos polares.
En concreto se han estudiado muestras de lagos hipersalinos de Mongolia Interior y del Tíbet en China, del lago Aran Bidgol en Irán y de las salinas de Isla Cristina en Huelva. Los estudios de biodiversidad microbiana revelaron el predominio de la familia Halobacteriaceae, siendo Natronorubrum y Halorubrum los género más abundantes en los dos primeros lagos y los géneros Haloarcula y Halorubrum en el lago Aran Bidgol y la salina de Isla Cristina.
Este estudio ha permitido hasta el momento la descripción de tres nuevas especies de arqueas halófilas extremas: Natronorubrum sediminis cepa CG-4 y CG-6T, Halorubrum aquaticum SH4 y EN-2T y Natronococcus roseus CG-1T, adicionalmente presentamos la descripción de catorce cepas consideradas como nuevas especies de haloarqueas, las cepas: T26T relacionada con el género Halostagnicola y trece cepas de Halorubrum que constituyen 4 nuevas especies representadas por las cepas tipo: Fb21T, Ib24T, Cb34T y C49T. Tanto los perfiles de lípidos polares de dichas cepas, los estudios de hibridación ADN-ADN y análisis de las secuencias del gen ARNr 16S y MLSA permitieron establecer relaciones filogenéticas y definir la posición taxonómica de las cepas estudiadas.
Finalmente, mediante el estudio de la composición de lípidos polares se han obtenido patrones lipídicos de las cepas de Natronococcus analizadas por cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC), dichos perfiles revelaron la presencia de lípidos relacionados con la cardiolipina; molécula involucrada en funciones bioenergéticas, (Corcelli y col., 2007). El estudio de lípidos inusuales de arqueas y la comparación con las características de lípidos de bacterias y eucariotas puede ayudarnos a comprender el origen y la evolución de la membrana celular. Los resultados preliminares derivaron en el estudio del lipidoma del género Natronococcus, mediante el uso de espectrometría de masas MALDI-TOF/MS, donde se evidenció en la membrana de haloarqueas la presencia de una nueva cardiolipina conformada por cadenas de diferente longitud que está presente en la membrana de Natronococcus no descrita previamente en haloarqueas (Angelini y col., 2012).
Los resultados que se han obtenido en esta tesis están abordados desde una perspectiva taxonómica que derivan a una interpretación ecológica, bioquímica y evolutiva, cuyo enfoque pretende contribuir al estudio de microorganismos de halófilos ofreciendo como pautas para mejorar el estudio y el entendimiento de los microorganismos halófilos y su rol biológico.
