La leptina y su receptor en tejido dental humano sano e inflamado
- Autores: Jenifer Martín-González
- Directores de la Tesis: Víctor Sánchez-Margalet (dir. tes.), Juan J. Segura Egea (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Lucas Lucas (presid.), Daniel Torres Lagares (secret.), Maeliosa Theresa Mccrudden (voc.), Leopoldo Forner Navarro (voc.), Fionnuala Teresa Lundy (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
INTRODUCCIÓN Uno de los aspectos más interesantes a los que en la actualidad se enfrenta la comunidad científica médica y odontológica es la posible conexión entre los procesos inflamatorios orales de origen infeccioso y el estado de salud sistémico (Seymour et al. 2009). Son numerosos los estudios epidemiológicos que han encontrado asociación entre el estado de salud general y estos procesos inflamatorios orales ( Soskolne et al. 2001; Janket et al. 2003; Jiménez Pinzón et al. 2004; Segura-Egea et al. 2005; Caplan et al. 2006; Ridao-Sacie et al. 2007)). La evidencia de esta asociación ha conllevado a una mayor atención al diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades orales en diversas situaciones clínicas, con la consiguiente mejora de la salud oral y sistémica de los pacientes.
Sin embargo no se conoce en profundidad la fisiopatología de los procesos inflamatorios pulpo-periapicales (pulpitis y periodontitis apical) en cuanto a aspectos básicos, moleculares y celulares. Su mejor conocimiento conllevaría un mejor conocimiento de su posible repercusión a nivel sistémico.
La pulpitis o inflamación pulpar se produce cuando, bien sea por caries o por traumatismos, las noxas y los microorganismos alcanzan el tejido pulpar desencadenando una respuesta inmune e inflamatoria (Jontell et al. 1998). Las bacterias causantes de la caries son también la causa principal de la infección y la inflamación pulpar, siendo la lesión que sufrirá el tejido pulpar el resultado de un proceso dinámico en el que, de un lado, están los microorganismos invasores y, de otro, la respuesta inmune e inflamatoria del huésped (Bergenholtz et al 2000). Para que se produzca la respuesta inflamatoria pulpar no es necesario que las bacterias alcancen físicamente la pulpa. Por el contrario, existen evidencias experimentales que demuestran que antígenos bacterianos y/o subproductos metabólicos pueden difundir a través de los túbulos dentinarios y provocar respuestas inmunes en la pulpa dental (Warfvinge et al 1985). Durante la respuesta inmune pulpar pueden formarse también complejos inmunes y liberarse, por fagocitosis, enzimas proteolíticos extracelulares que agravan y empeoran la inflamación pulpar (Bergenholtz et al 1977). En definitiva, la pulpitis se produce por un mecanismo inmunopatológico (Hahn et al 2007). Frente a agresiones leves o moderadas, la inflamación de la pulpa puede reparar el daño causado (pulpitis reversible), manteniéndose la vitalidad pulpar. En estos casos, el dolor aparece con ciertos estímulos y nunca es espontáneo. Por el contrario, si no se eliminan los factores agresivos y no se aplica una terapia de conservación y protección pulpar, terminará produciéndose una pulpitis irreversible y, en definitiva, la necrosis pulpar. La pulpitis irreversible es, pues, la respuesta inflamatoria aguda de la pulpa frente a la persistencia, crecimiento y progresión de las bacterias, u otro agente agresivo, en la cavidad pulpar (Canalda et al 2001). Cuando el proceso inflamatorio pulpar es irreversible, el paciente presenta dolor de intensidad creciente, espontáneo, episodios dolorosos cada vez más frecuentes y dolor que persiste después de eliminar el estímulo. Suele haber, antecedentes de lesiones cariosas profundas, exposición pulpar o restauraciones filtradas (Montgomery et al 1986). Sin embargo, en algunos casos la pulpitis irreversible puede cursar sin sintomatología, por lo que se distinguen dos formas clínicas de pulpitis irreversible: la sintomática y la asintomática (Pumarola et al. 2001) La periodontitis apical es la inflamación aguda o crónica del tejido que rodea a la raíz dentaria, generalmente entorno al ápice radicular, producida por la infección bacteriana de la pulpa dental (endodonto) (Eriksen et al.1998). La periodontitis apical se produce, en más del 90% de los casos, como secuela de la caries dental, una vez que ésta alcanza la pulpa dentaria provocando pulpitis y/o necrosis pulpar. El contenido polimicrobiano y/o antigénico del conducto radicular sale por el foramen apical, o por conductos laterales, e invade el tejido conectivo periapical o periradicular desencadenando una respuesta inflamatoria e inmune. La periodontitis apical puede ser aguda y sintomática o crónica y asintomática. La periodontitis apical aguda cursa con dolor y mínima reabsorción ósea, pudiendo, en ocasiones, ser reversible. La periodontitis apical crónica es una consecuencia de la necrosis pulpar y es, por ello, irreversible. Puede presentarse con cuatro cuadros anatomopatológicos: granuloma apical, absceso apical crónico, quiste apical y osteitis condensante (Pumarola et al 2001). Las lesiones osteolíticas periapicales o periradiculares, observables radiológicamente, son consecuencia de la destrucción ósea que conlleva el proceso inflamatorio crónico periapical o periradicular. La prevalencia de la periodontitis apical es muy alta en la población general, llegando en España al 61% de los individuos y al 4% de los dientes estudiados (Jiménez-Pinzón et al. 2004).
La leptina es una hormona peptídica no glicosilada de 167 aminoácidos y 16 kDa, altamente hidrofílica, codificada en el gen Ob (Zhang et al. 1994). La leptina es sintetizada principalmente y secretada por el tejido adiposo (Ahima et Flier. 2000) y fue descrita originalmente como una hormona derivada de los adipocitos para regular de manera central el control de peso, a través de su receptor en el hipotálamo (Flier,1995). Sin embargo, la leptina ha sido clasificada como una citoquina debido a que su secuencia primaria de aminoácidos muestra similitudes estructurales con la familia de citoquinas de larga cadena helicoidal (Zhang et. Al 1994, Saánchez-Margalet et al. 2003a,b). Por otra parte, el receptor de leptina (Ob-R) se expresa no sólo en el sistema nervioso central, sino también en los tejidos periféricos, tales como los sistemas hematopoyético e inmune (Sánchez-Margalet et al. 2003a, b). Por lo tanto, se ha propuesto que la leptina tiene un papel en la hematopoyesis y en el sistema inmune (Cioffi et al. 1996, Sánchez-Margalet et al. 2003a,b). Asimismo, se ha sugerido de que la leptina dirige la respuesta inmune del huésped mejorando la producción de citoquinas y la fagocitosis por los macrófagos (Fantuzzi y Faggioni 2000, Sánchez-Margalet et al. 2003a, b, Fernández-Riejos et al. 2010). Se ha demostrado que la leptina regula la respuesta inmune innata y adaptativa tanto en condiciones normales como en patológicas (Fernández-Riejos et al. 2010).
La presencia de leptina ha sido demostrada en tejidos gingivales sanos e inflamados (Johnson & Serio 2001), en el fluido crevicular gingival (Bozkurt et al. 2006, Karthikeyan y Pradeep 2007a, b, Dilsiza et al. 2010) y en lesiones periapicales crónicas humanas (Haghighi et al. 2010). Una concentración de leptina sérica elevada se ha asociado con un aumento de periodontitis crónica (Gundala et al. 2012). Recientemente, se ha descrito por primera vez que la leptina tiene efectos sobre las células madre de la pulpa dental, actuando como un importante modulador en la diferenciación de células madre mesenquimales pulpares (Um et al. 2011).
Por todo lo expuesto anteriormente, es plausible hipotetizar de que la leptina y su receptor se expresa en la pulpa dental así como en el tejido periapical humano y que juega un papel en la modulación de las respuestas inflamatoria e inmune locales. Sin embargo, a pesar de que ha sido previamente demostrado de que la leptina es sintetizada y secretada in vitro por fibroblastos pulpares derivados de molares sanos extraídos (El Karim et. al 2009), hasta la fecha, ningún estudio ha investigado su presencia ni la de su receptor en los tejidos pulpar y periapical humanos HIPÓTESIS La hipótesis alternativa de partida es que la leptina y su receptor se expresan en la pulpa dental y tejido periapical humanos, jugando un papel modulador de las respuestas inflamatoria e inmune pulpo-periapicales (pulpitis y periodontitis apical), OBJETIVOS I.- Determinar la expresión, mediante inmunodetección (WesternBlot) y PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a tiempo real, de leptina y su receptor en pulpa dental humana sana.
II.- Determinar la expresión, mediante inmunodetección (WesternBlot) y PCR a tiempo real, de leptina y su receptor en pulpa dental y tejido periapical humanos inflamados.
III.- Estudiar si existe asociación entre el grado de inflamación del tejido pulpar dental y el nivel de expresión de leptina y su receptor.
IV.-Identificar mediante las células que expresan el receptor de leptina en los tejidos dentarios objetos de estudio.
V.-Caracterizar las rutas de señalización de la leptina en los tejidos pulpar y periapical humanos.
METODOLOGÍA 1) Obtención de las muestras de tejido pulpar y periapical: - Pulpas dentales humanas sanas obtenidas de terceros molares extraídos, libres de caries y restauraciones y sin signos de enfermedad periodontal.
- Pulpas dentales humanas inflamadas experimentalmente mediante apertura de cámara y lesión directa traumática. Serán también obtenidas de terceros molares libres de caries y restauraciones y sin signos de enfermedad periodontal, pero a los que previamente a su extracción se les inducirá una inflamación experimental siguiendo el método descrito por Caviedes-Bucheli et al. (2005).
- Pulpas dentales humanas inflamadas obtenidas de pacientes con diagnóstico clínico de pulpitis irreversible.
-Tejido periapical humano (granulomas apicales y quistes apicales) extirpados como parte del tratamiento de dientes con periodontitis apical crónica.
2) Estudio de la expresión. Se realiza en tres pasos: 1.-Aislamiento de ARN: Todas las muestras serán homogenizadas con el reactivo ¿Trisure¿ (Bioline) siguiendo los pasos del protocolo del fabricante. Método de Chomczynski, P. Y Sacchi, N. (38) 2.-Retrotranscripción: Se va a usar el kit ¿Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit¿ (Roche) para retrotranscribir totalidad de ARN mensajeros de las muestras siguiendo los pasos del protocolo comercial.
3.-PCR a tiempo real: El análisis de la expresión génica se va a realizar usando ¿Sensimix Plus SYBR kit¿ (Quantance). Para la medida de expresión génica semicuantitativa se va a usar como gen de referencia ¿ciclofilina B¿. Todos los resultados se analizarán a través del tratamiento estadístico del ¿¿¿Ct¿, sacando los datos de las Ct¿s de la PCR con el sistema ¿miniOpticon¿ (Biorad) y siguiendo los siguientes ciclos (del 2º paso al 4º) hasta repetir 40: 1) 10¿ a 95ºC, 2) 95ºC durante 15¿¿ 3) 58ºC- 30¿¿ 4) 72ºC ¿ 30¿¿. La amplificación de los transcriptos serán confirmados con las curvas de melting (calentamiento gradual desde los 65ºC hasta los 95ºC con monitorización de la fluorescencia).
3) Inmunodetección (¿Western Blotting¿).
El reconocimiento de las proteínas separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a una membrana de nitrocelulosa con la ayuda de un campo eléctrico se realiza con anticuerpos específicos. La utilización de las técnicas de quimioluminiscencia enzimática con peroxidasa de rábano y luminol (ECL, en nuestro caso Super SignalR West Femto Maximum Sensitivity Substrate o West Dura Extended Duration Substrate) aumenta enormemente la sensibilidad de la detección de proteínas en las membranas.
Procedimiento: 1. Los lisados celulares solubles son desnaturalizados en el tampón de carga y se separan por SDS-PAGE.
2. El contenido del gel se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, mediante un sistema semi-seco a 30-35 V.
3. Para bloquear la unión inespecífica de los anticuerpos, la membrana se incuba a temperatura ambiente (25 ºC) y durante 30 minutos con albúmina al 3% en PBS-T( tampón salino con Tween 20) al 0,05%, con agitación suave (velocidad lenta). Transcurridos los 30 minutos, la membrana se lava con PBS-T cuatro veces, retirando el PBS-T después de cada uno de los lavados. Los lavados de la membrana se realizan con agitación también y a mayor velocidad. En este momento se puede detener el proceso dejando la membrana en estas condiciones a 4ºC, en PBS-T, hasta el día siguiente.
4. La membrana se incuba con el anticuerpo primario correspondiente durante toda la noche (a diluciones generalmente 1:1500 ó 1:2000) en PBS-T en agitación a velocidad lenta. Se lava cuatro veces durante 5 minutos con PBS-T.
5. Se incuba la membrana con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo o de ratón, según sea el primario policlonal o monoclonal, unido a peroxidasa de rábano a una dilución 1:10000. Se lava 4 veces con PBS-T.
6. Por último, se obtienen autorradiografías de la membrana. La peroxidasa de rábano se visualiza revelando la membrana mediante un sistema de quimioluminiscencia altamente sensible, empleando los kits ¿Super SignalR West Femto Maximum Sensitivity Substrate¿.
7. Las bandas obtenidas en los inmunoblots son escaneadas.
4) Preparación de un lisado celular proteico para estudios de señalización.
La unión de la leptina a su receptor desencadena una cascada de señalización intracelular que provoca todas las acciones descritas para esta hormona como consecuencia de la transducción de la señal. Para el estudio de las moléculas implicadas en su ruta de señalización en tejidos dentarios humanos, éstos se tratan con leptina durante un corto intervalo de tiempo (5 minutos) y se preparan lisados de las células procedentes de cada una de las concentraciones de leptina. Las proteínas celulares presentes en estos lisados se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, se transfieren a membrana de nitrocelulosa y se incuban con el anticuerpo que reconoce específicamente a la proteína participante de la ruta de señalización de la leptina que estudiamos en concreto.
Procedimiento: 1. Se cultivan los muestras de pulpa y tejido periapical en placas de Petri, en 10 ml de DMEM F-12 completo.
2. Se retira el medio, y se pone 4ml de medio basal sin suero y 4 ¿l de albúmina bovina a cada placa de cultivo. Cada una de las placas se tratan 5 minutos con distintas concentraciones de leptina (0-0,1-1-10 nM) incubándose a 37 ºC y 5 % de CO2.
3. Tras este tiempo de incubación, ya siempre se trabaja a 4 ºC. Se lavan las muestras con PBS frío, se añaden 1ml de tampón de lisis frío y con un rascador se rompen las muestras. Posteriormente ese lisado se pasan a tubos de 2 ml dejándose un mínimo de 30 minutos a 4ºC en rotación constante para que se produzca la solubilización de las proteínas.
4. Las muestras se centrifugan a 4 ºC durante 20 minutos a 13000 r.p.m.
5. El sobrenadante se traspasa a otro tubo de 2 ml. Retiramos una pequeña alícuota de 20 µl que emplearemos para la normalización de la concentración de proteínas.
6. La concentración de proteínas se determina por un kit de reactivos ¿Micro BCA Protein Assay Reagent Kit¿ (Pierce, Rockford, IL). Es un kit altamente sensible para la determinación colorimétrica cuantitativa del contenido proteico total en soluciones acuosas diluídas. Se utiliza el ácido bicinconínico (BCA) como reactivo de detección para el Cu+, formado cuando el Cu+2 se reduce por la proteína en un ambiente alcalino. El producto morado se forma por quelación de dos moléculas de BCA con una de Cu+. Este complejo soluble en agua tiene una absorbancia a 562 nm que es lineal con el aumento de la concentración de la proteína. La estructura macromolecular de la proteína junto con la presencia de cuatro aminoácidos (Cys, cistina, Tyr y Trp) en las proteínas son los responsables de la formación del color con el BCA tras la reacción. Se prepara una curva standard siendo el blanco el buffer de lisis (diluyente). Se sigue el protocolo que marca la casa comercial.
7. Tras la normalización de la cantidad de proteína se separa un volumen pequeño del lisado de células, alrededor de 100 µl, a otro tubo de 2 ml al que se le añade unos 30 µl de tampón-SDS de desnaturalización 5X con DTT 100 mM, o tampón de carga de electroforesis.
8. El lisado se desnaturaliza en el termobloque a 95 ºC durante 5¿. Se deja enfriar, para su posterior análisis en electroforesis de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) seguido de transferencia a membrana de nitrocelulosa para análisis de inmunoblot.
5 ) Análisis estadístico: - Prueba U de Mann-Whitney.
- Significación estadística: P<0,05.
PLAN DE TRABAJO Fase 1: Cuantificación del nivel de expresión de leptina y su receptor en tejido pulpar humano sano e inflamado.
Fase 2: Identificación de la célula portadora del receptor de leptina en tejido pulpar humano.
Fase 3: Cuantificación del nivel de expresión de leptina y su receptor en tejido periapical inflamado.
Fase 4: Caracterización de las vías de señalización estimuladas por la leptina.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES 1. El presente estudio es el primero en demostrar la expresión de la leptina y su receptor (LEPR) en el tejido pulpar dental humano sano e inflamado.
2. La presente investigación ha demostrado la sobre-regulación de la leptina y su receptor en la pulpa dental inflamada. Estos hallazgos, apoyan la idea de que la leptina participa en los procesos inflamatorios pulpares.
3. Las principales vías de señalización del receptor de leptina, MAPK, PI3K y JAK/STAT3, son activadas por la leptina en las células de la pulpa dental humana. Estos resultados proporcionan apoyo del posible papel de la leptina en la fisiología de la pulpa.
4. Los odontoblastos expresan receptor de leptina. La expresión del receptor de leptina se localiza en la capa de odontoblastos y en la predentina.
5. La leptina estimula la expresión de sialofosfoproteína. Por tanto, la leptina juega un papel en la mineralización de la dentina.
6. Este estudio es el primero en demostrar, tanto por inmunohistoquímica como por niveles de ARNm y de proteína, la expresión de la leptina y su receptor en los granulomas periapicales humanos. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la leptina participa en el proceso inflamatorio periapical.
7. Las células endoteliales mostraron inmunoreactividad a los anticuerpos de leptina en granulomas periapicales humanos. Entre las células inflamatorias presentes en los granulomas periapicales, sólo los macrófagos fueron reactivos a anticuerpos de LEPR. Las células plasmáticas, linfocitos, PMN, fibroblastos, o células endoteliales no mostraron expresión de LEPR. Estos hallazgos apoyan aún más el posible papel de la leptina en las respuestas inflamatorias e inmunes periapicales.
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