Dinámica de la topología del DNA durante la replicación

• Autores: Alicia Castán García
• Directores de la Tesis: Jorge Bernardo Schvartzman Blinder (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Espino Nuño (presid.), Francisco Javier Gallego Rodríguez (secret.), Crisanto Gutiérrez Armenta (voc.), Alicia Bravo García (voc.), José Arturo Calzada García (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Complutense de Madrid
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  Digital CSIC  Docta Complutense (pdf) 
• Resumen

  • Comprender como replica el DNA es una cuestión crítica para entender la vida. La replicación del DNA es un proceso complejo, en el que están implicadas una gran cantidad de moléculas. Actualmente, este proceso no está plenamente caracterizado. En la presente Tesis Doctoral se ha intentado profundizar en la comprensión de la replicación del DNA utilizando diferentes aproximaciones, a lo largo de sus distintas etapas. En una primera fase se trató de aportar información acerca de si las horquillas replicativas pueden girar libremente in vivo durante la replicación. Para ello se utilizaron tres plásmidos derivados de pBR322 que contenían clonada la secuencia para la terminación TerE a distintas distancias del origen de replicación. Con estos plásmidos se transformaron dos estirpes distintas de E. coli, una proficiente y otra deficiente en la Topoisomerasa IV. Se aislaron intermediarios de replicación que se analizaron mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa. Los resultados obtenidos permitieron concluir que las horquillas pueden girar libremente a medida que avanzan.

    En una segunda etapa, se estudiaron diferentes características de las barreras naturales para horquillas replicativas presentes en el rDNA. Estas horquillas son sumamente importantes para las células ya que evitan la colisión entre las maquinarias de replicación y transcripción en el rDNA. Para estudiar dichas horquillas se han utilizado varios minicromosomas artificiales de levaduras, que contenían distinto número de barreras. Se transformaron células de S. cerevisiae y se extrajeron intermediarios de replicación los cuales se digirieron con distintas enzimas de restricción para obtener dos fragmentos lineales, que fueron analizados por electroforesis bidimensional. Se obtuvieron una serie de resultados con los que se concluyó que las barreras naturales para las horquillas replicativas clonadas en minicromosomas artificiales de levaduras, detienen de manera permanente las horquillas. Sin embargo, no son capaces de detener el 100% de las mismas.

    Por último, se trató de determinar si la unión de proteínas iniciadoras de la replicación induce cambios en la topología del DNA. Para ello se utilizaron minicromosomas derivados de genomas víricos transfectados en células humanas (HEK 293). Este sistema es ampliamente utilizado para estudiar la replicación en organismos eucariotas, ya que los minicromosomas están sometidos a restricciones muy similares a las de la célula huésped, pero representan un sistema mucho más simple y mejor caracterizado. Se utilizaron dos minicromosomas, uno derivado del genoma del virus de Epstein-Barr y otro derivado del virus de SV40. Ambos necesitan la presencia de una proteína vírica para replicar de forma autónoma y extracromosómicamente. Dichas proteínas iniciadoras son EBNA1 y el Antígeno T, respectivamente. Se transfectaron las células HEK293 y 40h después se aisló el DNA extracromosómico que se analizó mediante electroforesis bidimensional. Se pudo concluir que la unión de distintas proteínas iniciadoras no afecta a la topología de estos minicromosomas.