Resumen de A coordinated pathway for nitrate assimilation and nitric oxide detoxification in Bradyrhizobium diazoefficiens
- español
El nitrógeno (N) es uno de los componentes esenciales para la vida, con una gran demanda para los seres vivos. Frecuentemente es el factor limitante para el crecimiento de muchos organismos, ya que, aunque constituye el 78% de la composición del aire (N2), solamente una pequeña proporción de los organismos, los diazótrofos, son capaces de fijarlo (Martinez-Espinosa et al., 2011). Sin embargo, la mayoría de los organismos utilizan compuestos nitrogenados disponibles en el medio ambiente, presentes como una amplia variedad de moléculas que contienen nitrógeno en diferentes estados de oxidación, y que conforman el ciclo del nitrógeno siendo la más abundante el nitrato (NO3-).
La asimilación de NO3- es un proceso ubicuo realizado por procariotas, hongos, algas y plantas superiores, clave para movilizar este compuesto, cuya acumulación provoca problemas medio ambientales y de salud pública (Guerrero et al., 1981). Bioquímicamente, la reducción asimilativa del NO3- siempre tiene lugar por una enzima nitrato reductasa con un centro activo de molibdeno, donde el NO3- es reducido a nitrito (NO2-). A continuación, el NO2- es reducido hasta amonio (NH4+) por una enzima nitrito reductasa con un grupo sirohemo en su centro activo. Finalmente, el NH4+ es incorporado en esqueletos carbonados para su utilización en el metabolismo celular (Moreno-Vivián et al., 2011).
El NO3-, además puede ser utilizado por microorganismos como aceptor final de electrones en cadenas respiratorias, siendo la más importante la desnitrificación, proceso en el cual el NO3- es reducido hasta N2 con los intermediarios NO2-, óxido nítrico (NO) y óxido nitroso (N2O), los dos primeros, NO2- y fundamentalmente el NO, tóxicos para las células (Stern & Zhu, 2014).
Bradyrhizobium diazoefficiens es una α-proteobacteria, diazótrofo del orden Rhizobiales, capaz de crecer con NO3- como única fuente de nitrógeno, tanto para asimilarlo, como aceptor final de electrones, para respirarlo, mediante la desnitrificación. B. diazoefficiens es conocido principalmente, por asociarse simbióticamente con plantas de soja (Glycine max). La asociación simbiótica entre la planta y B. diazoefficiens, se establece en unas estructuras especializadas de la raíz de la planta, llamadas nódulo, donde tiene lugar la fijación biológica del N2, y en el caso particular de B. diazoefficiens, también la desnitrificación (Bedmar et al., 2013).
Estudios previos realizados por el Grupo del Metabolismo del Nitrógeno del Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos de la Estación Experimental del Zaidín (CSIC-Granada) habían demostrado que la hipoxia y el NO3- inducen la formación de NO en los nódulos de soja (Sanchez et al., 2010). Debido al efecto inhibidor del NO sobre la actividad nitrogenasa, era de esperar la presencia de mecanismos que lo eliminaran dentro del nódulo. Estudios realizados por Meakin y colaboradores (2006) sugerían la existencia en los nódulos de sistemas para la destoxificación de NO adicionales a la propia enzima NO reductasa de la ruta de la desnitrificación.
En el genoma de B. diazoefficiens, localizamos la presencia de una hemoglobina, Bjgb, codificada por el gen blr2807 (bjgb), que posee alta homología con las hemoglobinas de dominio único Vgb y Cgb de Vitreoscilla stercoraria y Campylobacter jejuni, cuyo papel en destoxificación de NO estaba ya demostrado (Sánchez et al., 2011). Junto al gen bjgb responsable de la síntesis de Bjgb, se encuentran otros genes responsables de la síntesis de proteínas potencialmente implicadas en la asimilación de nitrato, tales como blr2803-05 (nrtABC) que codifican un transportador de nitrato tipo ABC; blr2806 (narK), responsable de una proteína implicada en el transporte de NO3-/NO2-; blr2808 (flp), que codifica una flavoproteína; y blr2809 (nasC) implicada en la síntesis de la nitrato reductasa asimilativa. Por otra parte, distalmente, se encuentran genes también implicados en asimilación de NO3-, bll4571 (nirA), que codifica la nitrito reductasa asimilativa; y bll4572-73 (nasST), responsables de la síntesis de un regulador de respuesta a NO3-/NO2-.
Mediante diferentes aproximaciones experimentales, en esta Tesis Doctoral hemos podido demostrar la implicación de los genes blr2806-blr2809 y bll4572-73 en la asimilación de NO3- y NO2- de B. diazoefficiens. Así como, la función de Bjgb, como mecanismo para la eliminación del NO generado por NasC durante la asimilación de NO3-, lo que hace a este grupo de genes un sistema coordinado para la asimilación de NO3- y NO2- y destoxificación de NO, descrito por primera vez en bacterias. Adicionalmente, hemos caracterizado los elementos más importantes de la regulación de estos genes, e identificado los reguladores que intervienen en la expresión de los mismos.
En esta Tesis Doctoral, se ha llevado a cabo la construcción de cepas de B. diazoefficiens mutantes en fase por deleción, en cada uno de los genes blr2803-blr2809 y bll4572-73 El análisis fenotípico de las mutantes, ha permitido demostrar que NasC y NirA son las subunidades catalíticas para la reducción asimilativa de NO3- y NO2-, respectivamente. Ambas cepas mutantes para nasC y nirA, son incapaces de crecer con NO3- como única fuente de nitrógeno. En el caso de la mutante nirA, tampoco fue capaz de crecer con NO2- y lo acumuló en presencia de NO3- en el medio, lo que indica que la asimilación de NO3- queda bloqueada a nivel de la reducción de NO2-. Esta hipótesis, fue confirmada al cuantificar la actividad NO3- y NO2- reductasa de ambas mutantes, mientras que la mutante nasC carece de actividad NO3- reductasa, pero mantiene la NO2- reductasa, ocurre lo contrario en la cepa mutante nirA. Además de NasC y NirA, en esta Tesis se ha demostrado la implicación de la flavoproteína (Flp) en la asimilación de NO3-, puesto que una cepa mutante flp fue incapaz de crecer únicamente con esta fuente de nitrógeno, sin embargo, no interviene en el mecanismo catalítico, sino en la transferencia electrónica a NasC, debido a que esta cepa no pierde la actividad NO3- reductasa cuando se usa un donador artificial de electrones.
La implicación de la hemoglobina de dominio único Bjgb en destoxificación de NO, se ha demostrado al verificar que la cepa mutante en este gen presenta un déficit de crecimiento en anaerobiosis con NO3-. Además, en presencia de un agente donador de NO, la cepa mutante bjgb mostró un retraso en su crecimiento, al igual que una mutante en flp, lo que indica que posiblemente los electrones que necesita Bjgb para eliminar el NO se los proporciona Flp. Adicionalmente, en una mutante bjgb, la expresión del promotor del gen norC, dependiente de NO, se induce, indicando un aumento de la concentración de NO en esta cepa, lo cual se ha verificado al observar un aumento en la capacidad de consumir NO y de producir N2O en la cepa mutante bjgb. NarK, posiblemente actúa como un nivel adicional de control para la eliminación de NO2- intracelular, que puede conducir a la producción de NO, sin embargo, bajo nuestras condiciones experimentales, la eliminación de NO2- del interior de la célula que realiza NarK, provoca una limitación en el crecimiento con NO3- o NO2- como únicas fuentes de nitrógeno.
A nivel genético, hemos verificado que los genes narK-bjgb-flp-nasC se transcriben como una unidad policistrónica bajo el control de un promotor situado en narK, con un inicio de la transcripción identificado por 5’-RACE, y que nirA está controlado por un promotor situado en el espacio intergénico previo a éste. En la región promotora de narK se ha identificado una secuencia consenso o caja FNR, además de cajas NtrC o la formación de horquillas con las secuencias ANTAR en el inicio de sus ARN mensajeros que se han localizado tanto en la región promotora de narK como de nirA. La funcionalidad de estos elementos reguladores se ha confirmado mediante el empleo de cepas de B. diazoefficiens mutantes en el gen ntrC, que es responsable de la síntesis del regulador transcripcional NtrC implicado en la regulación general por compuestos nitrogenados. Una cepa mutante en el gen ntrC es incapaz de crecer con NO3- como única fuente de nitrógeno, y presenta un considerable defecto en el crecimiento con NO2-, careciendo esta cepa de las actividades NO3- y NO2- reductasas, así como mostrando bajos niveles de expresión de las fusiones transcripcionales narK-lacZ y nirA-lacZ. De forma similar, la cepa mutante del regulador de respuesta a NO3-/NO2- NasT, es incapaz de crecer con NO3- y NO2-, y mostró valores reducidos de actividades nitrato y nitrito reductasa, así como de expresión narK-lacZ y nirA-lacZ comparados con los niveles observados en la cepa parental. Estos resultados confirman la implicación de las horquillas presentes en el ARN mensajero de las regiones promotoras de los genes narK y nirA en la terminación prematura de la transcripción en ausencia de la proteína NasT. Por último, se ha verificado la dependencia de los promotores narK y nirA del factor sigma σ54 de la ARN polimerasa para su transcripción, ya que una mutante en los genes responsables (rpoN1/2) también mostró un déficit en crecimiento, actividades NO3- y NO2- reductasas y expresión génica.
En conjunto, estos resultados conforman una detallada caracterización, a nivel fisiológico, bioquímico y de regulación génica, de un sistema coordinado de asimilación de NO3- y NO2- y destoxificación de NO en B. diazoefficiens, ambos procesos escasamente estudiados en rizobios, siendo la primera vez que este sistema se ha descrito en bacterias.
- English
Nitrogen (N) is one of the essential compounds, with a great demand by living organisms. Frequently, N is a limiting factor because, even it constitutes 78% of the air composition (N2), only few organisms, the diazotrophs, are able to fix it (Martinez-Espinosa et al., 2011). Mainly, N-assimilation by organisms is provided from different nitrogenous molecules present in the environment, that form part of the nitrogen cycle, being the most abundant molecule, nitrate (NO3-).
NO3- assimilation is a ubiquitous process carried out by prokaryotic, fungi, algae and higher plants. This process is a key to mobilizing this compound, whose accumulation causes environmental and public health problems (Guerrero et al., 1981). Biochemically, the assimilative reduction of NO3- always occurs by a nitrate reductase enzyme with an active molybdenum centre, where NO3- is reduced to NO2-. Next, NO2- is reduced to ammonium (NH4+) by a nitrite reductase enzyme with a sirohaem group at its active site. Finally, NH4+ is incorporated into carbon skeletons to be used in cell metabolism (Moreno-Vivián et al., 2011).
Microorganisms can also use NO3- as final acceptor of electrons in respiratory chains. Denitrification is the most important, in which NO3- is reduced to N2 through the formation of NO2-, nitric oxide (NO) and nitrous oxide (N2O) as intermediates, being NO2- and mainly NO toxic for the cells (Stern & Zhu, 2014).
This Doctoral Thesis is focus in the rizobia species Bradyrhizobium diazoefficiens, an α-proteobacteria from the Rhizobiales order, able to grow with NO3- as sole N-source, both to assimilate it, and to use as the final electron acceptor, through denitrification. B. diazoefficiens is known mainly for its capacity to associate symbiotically with soybean plants (Glycine max). The symbiotic association between the plant and B. diazoefficiens is established in specialized structures of the plant root, called nodules, where the biological N-fixation as well as denitrification occurs (Bedmar et al., 2013).
Previous studies carried out by the Nitrogen Metabolism Group of the Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems from Estación Experimental del Zaidín (CSIC-Granada) showed that hypoxia and NO3- induce NO formation inside the nodules (Sanchez et al., 2010). Due to the inhibitory effect of NO on nitrogenase activity, it is expected the presence of mechanisms to eliminate NO within the nodule. Studies by Meakin et al. (2006) suggested the presence in nodules, of others NO detoxification systems in addition to the denitrification enzyme NO reductase.
In the B. diazoefficiens genome, we could find the presence of an haemoglobin, Bjgb; encoded by blr2807 (bjgb), which showed high homology with the single domain haemoglobins Vgb and Cgb of Vitreoscilla stercoraria and Campylobacter jejuni, whose role in NO detoxification were already demonstrated (Sánchez et al., 2011). In the same cluster where bjgb is located, there are other genes putative roles in NO3- assimilation; blr2803-05 (nrtABC), that encodes an ABC type nitrate transporter; blr2806 (narK), responsible for a NO3-/NO2- transporter; blr2808 (flp), encoding a flavoprotein; and blr2809 (nasC), implicated in the synthesis of the assimilatory NO3- reductase. On the other hand, at other location in the chromosome, we have identified genes also involved in NO3-/NO2- assimilation; bll4571 (nirA), encoding the assimilatory NO2- reductase; and bll4572-73 (nasST), responsible for a NO3-/NO2- responsive regulator.
By using different experimental approaches, in this Doctoral Thesis we have been able to demonstrate the implication of blr2806-09 and bll4571-73 genes in NO3- and NO2- assimilation in B. diazoefficiens. As well as the function of the Bjgb, as a protein involved in detoxification of NO, molecule that is generated by NasC during NO3- assimilation. These findings propose the identification of a new coordinated system for NO3- and NO2- assimilation and NO detoxification described by first time in bacteria. In addition, we have also investigated the regulation of this system as well as identified the regulators involved in its expression.
In this Thesis, we have constructed B. diazoefficiens in-frame deletion mutant strains in blr2806-09 and bll4571-73 genes and we have performed the phenotypic characterization of the mutants. In fact, we have demonstrated that NasC and NirA proteins are the catalytic subunits for NO3- and NO2- assimilatory reductases, respectively. Both nasC and nirA mutant strains, were unable to grow with NO3- as the sole N-source. In the case of the nirA mutant, it was not able to grow with NO2- and accumulated it in the presence of NO3- in the medium, which indicates that the NO3-assimilation is blocked at NO2- reduction level. This hypothesis was confirmed by quantification of NO3- and NO2- reductase activity in both mutants, while the nasC mutant lacks NO3- reductase activity, but NO2- reductase remains. The opposite occurs in the nirA mutant strain. We have also shown that the flavoprotein (Flp) is also involved in NO3- assimilation, given the incapacity of the flp mutant to grow with NO3- as the only N-source. We propose that Flp is implicated in the electron transfer to NasC, but not to NirA.
In this Thesis, we have also demonstrated the implication of Bjgb in NO detoxification given the growth decrease it observed in anaerobiosis with NO3- compare to the parental strain. Moreover, in the presence of a NO-donor, bjgb strain showed a delay in growth, like a flp mutant, indicating that possibly the electrons needed by Bjgb to remove NO are provided by Flp. In addition, the NO-dependent nor genes expression is induced in a bjgb mutant, probably due to an increase in NO concentration in this strain. The induction of nor in the bjgb mutant was also verified by measuring NO consumption activity and N2O production in this strain, parameters that were higher than those from the wild-type cells. NarK, possibly acts as an additional level of control to remove intracellular NO2-, which might lead to NO production. However, under our experimental conditions, elimination of NO2- from inside the cell by NarK causes a limitation on growth with NO3- or NO2- as sole N-sources.
In this work, we have identified that the narK-bjgb-flp-nasC gene cluster is transcribed as a polycistronic unit under the control of a promoter upstream of narK, with a transcription start site identified by 5'-RACE, and that nirA gene is controlled by a promoter located in the intergenic space before it. The narK promoter region presents some regulatory elements such as FNR box, and also NtrC boxes or the formation of hairpins with the ANTAR sequences at the start of mRNA that were found in narK as well as nirA promoter regions. The functionality of the regulatory elements found has been confirmed by using mutant strains for the candidate transcriptional regulators involved. In fact, a mutant strain defective in NtrC, the transcriptional regulator involved in the general regulation of N-compounds, was unable to grow with NO3- as sole N-source, and also showed a growth defect with NO2-, as well as decreased rates of NO3- and NO2- reductases activities and expression of a narK-lacZ and nirA-lacZ transcriptional fusions. Similarly, the NO3-/NO2- response regulator nasT mutant strain was unable to grow with NO3- and NO2-, confirming the implication of the hairpins present in the mRNA of these genes in the premature transcriptional termination in the absence of NasT. Finally, the dependence of the narK and nirA promoters on the sigma factor σ54 of the RNA polymerase has been verified, since a mutant defective in the rpoN1/2 genes encoding this factor σ54, also exhibited a defect in growth, as well as in NO3- and NO2- reductases activities and gene expression.
By concluding, in this Thesis, we have performed a detailed characterization, at the physiological, biochemical and regulatory levels, of a new coordinated system for NO3- assimilation and NO detoxification in B. diazoefficiens. As far as we know, this is the first time where a coordinated system like this has been described in bacteria.
