Papel de las proteinas reguladoras de la familia RSM en la señalización mediada por diguanilato cíclico y el modo de vida multicelular de pseudomonas putida kt2440
- Autores: Óscar Huertas Rosales
- Directores de la Tesis: Manuel Espinosa Urgel (dir. tes.), Maria Isabel Ramos-Gonzalez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rafael Salto González (presid.), Inmaculada Llamas Company (secret.), Stephan Heeb (voc.), Angel Jesús Matilla Carro (voc.), Cristina Solano Goñi (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
En el medio ambiente, las bacterias se encuentran predominantemente formando comunidades multicelulares adheridas a superficies, conocidas como biopelículas o biofilms (Wingender et al., 1999). En una biopelícula, las células bacterianas ancladas a superficies bióticas o abióticas se hallan embebidas en una matriz compleja producida por las propias bacterias, entre cuyos componentes se encuentran exopolisacáridos (EPSs), proteínas, lípidos y ADN extracelular (Hall-Stoodley et al., 2004). Esta matriz extracelular ayuda a proteger a las células frente a factores de estrés. La formación de biofilms es un proceso altamente regulado que responde a diferentes señales ambientales (Costerton et al., Flemming y Wingender, 2010; Römling y Balsalobre, 2012). La red de regulación que conecta estos estímulos con cambios en la expresión génica asociados al desarrollo del biofilm es compleja y no del todo conocida. En ella, el segundo mensajero intracelular diguanilato cíclico (c-di-GMP) juega un papel clave, modulando la transición entre el estilo de vida planctónico, mótil, al modo de vida sésil de un biofilm (Zhang y Dong, 2004).
Esta tesis se ha centrado en el papel que juega la familia de reguladores globales post-transcripcionales Rsm en la regulación de la formación de biopelículas bacterianas y la señalización por c-di-GMP, usando como modelo Pseudomonas putida KT2440, una bacteria de interés agrícola por sus propiedades como PGPR. Trabajos previos del grupo habían determinado que el sistema de dos componentes GacS/GacA regula la expresión de adhesinas implicadas en la formación de biofilms por esta bacteria. Dado que en otros microorganismos este sistema de dos componentes forma parte de una cascada de regulación mediada por proteínas de la familia Rsm, los objetivos de esta Tesis han sido caracterizar dichas proteínas en P. putida KT2440, analizar su implicación en la formación de biofilms y la señalización por c-di-GMP, e iniciar un estudio de su papel como reguladores globales.
En el capítulo 1, “Self-Regulation and Interplay of Rsm Family Proteins Modulate the Lifestyle of Pseudomonas putida”, se describe el papel de las tres proteínas de la familia de reguladores post-transcripcionales de tipo CsrA/RsmA presentes en P. putida KT2440 (RsmA, RsmE y RsmI) en el estilo de vida de la bacteria, a través de la construcción de mutantes simples, dobles y triple, así como la sobreexpresión de los genes por separado y bajo la influencia de un promotor constitutivo. Así, se observó que un mutante triple presenta menos movilidad tanto de tipo “swimming” como de tipo “swarming” además de dinámica alterada de formación de biopelícula, en la que se observa mayor biomasa adherida a la superficie pero una dispersión más temprana del biofilm. Por el contrario, la sobreexpresión tanto de RsmE como de RsmI provoca una disminución en la capacidad de adhesión. El análisis de la expresión de los diferentes EPSs y adhesinas en los fondos mutantes reveló que estos cambios podrían deberse a una alteración en la composición de la matriz extracelular así como en los tiempos de síntesis de ésta (Huertas-Rosales et al., 2016) En el capítulo 2, “The Pseudomonas putida CsrA/RsmA homologues negatively affect c-di-GMP pools and biofilm formation through the GGDEF/EAL response regulator CfcR”, se profundiza en el estudio de la regulación de la expresión de cfcR, que codifica el único regulador de respuesta con dominios GGDEF/EAL en KT2440. Esta proteína está regulada a nivel transcripcional por RpoS, ANR y FleQ y su funcionalidad como diguanilato ciclasa require del multisensor histidina kinasa CfcA. En este capítulo se describe un nivel adicional de regulación de cfcR que opera a nivel post-transcipcional a través de las proteínas RsmA, RsmE y RsmI. Se ha demostrado la unión directa de estas proteínas a un motivo específico (5´-CAUGGAUG-3´) que solapa con el codón de inicio de la traducción de cfcR. La mutación de las proteínas Rsm causa una desrepresión de cfcR. Demostramos, por otro lado, que los niveles de diguanilato cíclico intracelular en KT2440 en fase estacionaria se deben en su mayoría a la acción de CfcR y que su mutación provoca una bajada crítica en estos niveles. En un triple mutante en Rsm, se puede observar que los niveles de c-di-GMP no solamente son superiores sino que además se elevan significativamente durante la fase exponencial de crecimiento de la bacteria. Los resultados de este capítulo permiten establecer que la cascada de señalización Gac/Rsm/c-di-GMP opera en P. putida a través de CfcR.
En el tercer capítulo, “Global analysis of the Rsm regulon in Pseudomonas putida KT2440”, se ha realizado un estudio de RIP-seq para dilucidar de forma global los genes que podrían estar regulados de forma directa por las proteínas Rsm en P. putida. Más de 400 genes, regiones intergénicas y posibles sRNA son diana de estas proteínas, algunas específicas para cada una de ellas y otras que son compartidas por dos (95) o las tres (38) proteínas Rsm. Hemos comprobado que tanto cfcR como elementos implicados en su regulación aparecen entre las dianas, como era esperable a partir de los resultados del capítulo 2. También aparecen otros genes relacionados con la formación de biofilms. Aunque el análisis de dianas realizado es preliminar, este ha permitido generar el listado de genes y nuevos sRNA cuyo estudio nos permitirá completar el mapa de la regulación asociada a proteínas Rsm en P. putida KT2440.
- English
In the environment, most bacteria form multicellular communities associated to surfaces, called biofilms (Wingender et al., 1999). In a biofilm, bacterial cells anchored to biotic or abiotic solid surfaces are surrounded by a complex self-produced matrix consisting on exopolysaccharides, proteins, lipids and extracellular DNA(Hall-Stoodley et al., 2004). The structural components of the biofilm matrix give rise to a robust structure that aids in the protection of enclosed bacterial populations from adverse conditions. Biofilm formation is a highly regulated process which responds to different environmental signals (Costerton et al., 1999; Flemming and Wingender, 2010; Römling and Balsalobre, 2012). The regulatory network that connects these stimuli with changes in gene expression is complex and not totally understood. In this network, the intracellular second messenger cyclic diguanilate (c-di-GMP) is a key element that modulates the transition from motile, planktonic life to the biofilm lifestyle (Zhang and Dong, 2004).
This Doctoral Thesis has been focused on the role of the Rsm family of global post-transcriptional regulators on bacterial biofilm formation and c-di-GMP signaling, using as a model system Pseudomonas putida KT2440, a bacterium of agronomic interest for its properties as PGPR. Earlier work in the research group had established that the two-component regulatory system GacS/GacA controls expression of adhesins required for biofilm formation in this bacterium. Given that in other microorganisms this two-component system is part of a regulatory cascade mediated by Rsm family proteins, the objectives of this Thesis have included the characterization of these proteins in P. putida KT2440, analyzing their involvement in biofilm formation and c-di-GMP signaling, and to begin studying their role as global regulators.
Chapter 1, “Self-Regulation and Interplay of Rsm Family Proteins Modulate the Lifestyle of Pseudomonas putida”, describes the role of the three proteins of the CsrA/RsmA family of post-transcriptional regulators present in P. putida KT2440 (RsmA, RsmE and RsmI) in the lifestyle of this bacterium. For that purpose, single, double and a triple mutant were constructed and characterized, and the three genes overexpressed under the control of a constitutive promoter. The triple mutant showed reduced swimming and swarming motility, and altered dynamics of biofilm formation. The biomass attached to abiotic surfaces is higher than in the wild type, but the biofilm disperses earlier, although the phenotype varies on different surfaces. On the other hand, overexpression of RsmE or RsmI causes reduced biofilm formation. Expression analysis of the different adhesins and exopolysaccharides revealed that these alterations could be due to changes in the extracellular matrix and in the timing of synthesis of its elements (Huertas-Rosales et al., 2016) In chapter 2, “The Pseudomonas putida CsrA/RsmA homologues negatively affect c-di-GMP pools and biofilm formation through the GGDEF/EAL response regulator CfcR”, we expanded the study of the regulation of cfcR expression. This gene encodes the unique response regulator with GGDEF/EAL domains in P. putida KT2440. Expression of cfcR is regulated at the transcriptional level by RpoS, ANR and FleQ, and its diguanylate cyclase activity requires the multisensor hybrid histidine kinase CfcA. In this chapter, an additional level of regulation is described, operating at the post-transcriptional level through RsmA, RsmE and RsmI. Direct binding of these proteins to a specific motif overlapping the initiation codon of cfcR (5´-CAUGGAUG-3´) is demonstrated. The lack of Rsm proteins causes de-repression of cfcR. We also show that in stationary phase the c-di-GMP pool in KT2440 is mostly dependent on the activity of CfcR, and that in a triple rsm mutant the levels of second messenger are not only higher but increase earlier during growth. Results from this chapter allow us to establish that the Gac/Rsm/c-di-GMP signaling cascade operates in P. putida through CfcR.
In the third charper “Global analysis of the Rsm regulon in Pseudomonas putida KT2440”, a RIP-seq study was performed to elucidate all possible genes that are directly regulated by Rsm proteins in P. putida. Over 400 genes, intergenic regions and potential sRNA are targets for these proteins, some being specific for each of them and others being shared by two (95) or the three (38) Rsm proteins. We have confirmed that cfcR and elements involved in its regulation are among the identified targets, as expected from the results in chapter 2. Other biofilm related genes have also been found in this study. Although the analysis of targets is still preliminary, thanks to this work we have a long list of genes and new sRNA that will allow us to complete the regulatory map associated to Rsm proteins in P. putida KT2440.
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