Resumen de Nacre ultrastructure: Amorphous precursors, aggregation and crystallization
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Resumen Los biominerales son materiales compuestos sintetizados por organismos. Un material compuesto se define como el resultante de la combinación de dos o más materiales distintos y estructuralmente complementarios. El material compuesto presenta ciertas propiedades estructurales o funcionales que no se encuentran en los componentes individuales, sino que resultan de su interacción. Estos componentes normalmente involucran una matriz orgánica y un material de refuerzo, organizados de una forma jerárquica. El hueso de vertebrados, las espinas de equinodermos y las conchas de moluscos son ejemplos de biomateriales compuestos. Los estudios de biomineralización tienen como objetivo entender la formación, estructura y propiedades de los minerales depositados por sistemas biológicos.
Los moluscos son excelentes productores de biominerales. Haciendo uso de un reducido número de elementos (las conchas están compuestas principalmente de carbonato cálcico, en forma de calcita o aragonito, y un 1-5.5 % de materia orgánica), pueden producir más de una docena de microestructuras. Los cristales y la matriz orgánica se organizan en microestructuras, que se caracterizan por presentar relaciones espaciales y cristalográficas recurrentes. Frecuentemente las conchas están por capas con diferentes microestructuras, e incluso diferentes mineralogías. Para que esto ocurra, los organismos ejercen un exquisito control a varios niveles para regular el transporte, la agregación y la deposición del mineral.
Los procesos de formación de las diferentes microestructuras son de gran interés, en parte debido a su aplicabilidad en el desarrollo de materiales biomiméticos. Uno de los temas candentes a día de hoy es la formación de materiales cristalinos a través de fases amorfas. Su descubrimiento atrajo gran interés científico, ya que los modelos clásicos de crecimiento cristalino desarrollados en el último siglo se basaban en mecanismos de adición de iones, pero no contemplaban el crecimiento mediante la adición de partículas de mayor tamaño.
El presente trabajo aborda el tema de los precursores amorfos en una de las microestructuras de moluscos mejor estudiadas, el nácar. La presencia de carbonato cálcico amorfo (ACC, por sus siglas en inglés) en las tabletas de nácar en formación ha sido demostrada recientemente. Nuestra aproximación ha sido hacer un estudio de alta resolución aunando dos técnicas principales: imagen y análisis elemental. Hemos estudiado tres fases del proceso de formación del nácar usando como sistema modelo una especie de gasterópodo. Los gasterópodos tienen la peculiaridad de presentar una membrana densa (la membrana superficial) que cubre el compartimento de mineralización. Las membranas orgánicas (membranas interlamelares) se disponen en este compartimento y entre ellas crecen las placas minerales. Las placas de nácar de gasterópodos se apilan formando torres.
Los tres bloques en los que se divide esta tesis doctoral se enumeran a continuación: - Determinación del mecanismo de transporte del ACC: función de las vesículas y dinámica de la membrana superficial.
- Caracterización del ACC en las tabletas en formación (distribución y relación con la fase cristalina).
- Estudio de la morfología resultante en las tabletas maduras (nanogranularidad).
Para el primer bloque hemos usado microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectroscopía de pérdida de energía de electrones (EELS). Hemos visualizado y analizado las vesículas que segregan las células del manto y la membrana superficial. Los resultados muestran que algunas de estas vesículas transportan material rico en calcio unido a la superficie interna de la vesícula; también hemos encontrado calcio en la doble membrana de las vesículas. La membrana superficial y las membranas interlamelares muestran cierta cantidad de calcio. La membrana superficial sufre un proceso de cambio en su estructura y pasa de un aspecto denso y poco estructurado en el lado del manto, a una estructura porosa bien definida en el lado del compartimento de mineralización. Cuando las membranas interlamelares se separaran de la membrana superficial, dicha estructura porosa es evidente.
Para el segundo bloque, sobre el estudio de la trasformación y cristalización del ACC, se han tomado imágenes mediante TEM/STEM. Las tabletas en formación están compuestas por la agregación de partículas globulares (20-50 nm) que presentan un núcleo cristalino (30 nm de tamaño medio) embebido en una matriz amorfa (5-10 nm de espesor). Esta capa amorfa está compuesta de una mezcla de material orgánico y ACC, ambos identificados mediante EELS. Los nanodominios cristalinos presentan formas complejas, pseudo-dendríticas, que podrían conectar en la tercera dimensión.
El tercer bloque de esta tesis lo compone el estudio de las lineaciones en la superficie de las tabletas de nácar. Se ha llevado a cabo mediante microscopia electrónica de barrido, difracción de electrones retrodispersados (EBSD) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Las imágenes demuestran claramente que las lineaciones son el resultado de la agregación de nanoglóbulos de carbonato cálcico. Los mapas de EBSD muestran que las lineaciones están orientadas según el eje a de las tabletas. Nuestro modelo propone que esta morfología resulta de la absorción diferencial de macromoléculas a lo largo de los ejes cristalográficos del aragonito.
Finalmente, cabe decir que los resultados de las dos últimas secciones encajan bien, reforzando nuestra hipótesis de que el patrón nanogranular característico de los biominerales puede no representar los tamaños de las unidades de agregación como han sugerido ciertos autores, sino que, más bien, es resultado del proceso de cristalización posterior.
- English
Abstract Biominerals are organo-mineral composites synthetized by organisms. A composite is defined as the material that results from the combination of two or more different and structurally complementary materials. A composite has certain structural or functional properties, which are not present in the individual components. These emergent properties appear from the interaction of their individual constituents, which normally involves an organic matrix and a reinforcing material, organized in a hierarchical manner. Vertebrate bone, echinoderm spines and molluscs shells are some examples of composite biomaterials. The field of biomineralization aims to understand the formation, structure and properties of the minerals deposited by biological systems.
Molluscs are excellent biocomposite constructors. Making use of a reduced number of elements (shells are mainly composed of calcium carbonate, in the form of calcite or aragonite, and 1-5.5% of organic material) they can produce more than a dozen microstructures. Crystallites and the organic matter organize into particular patterns termed microstructures, characterized by recurrent spatial and crystallographic relationships. Frequently, shells are composed by layers with different microstructures, and even different mineralogies. For this to occur, organisms exert an exquisite multi-level control over the transport, aggregation and deposition of the mineral.
The formation processes of the different microstructures are of great interest, in part due to their applicability in the development of biomimetic materials. One of the hot topics today is the formation of crystalline materials through amorphous phases. Its discovery attracted great scientific interest, since the classical mineralization models developed in the last century described the crystal growth through the addition of ions, but not by aggregation of higher-order particles.
The present PhD work addresses the issue of the amorphous precursors in one of the best studied mollusc microstructures, the nacre. The presence of amorphous calcium carbonate (ACC) in the forming tablets has been recently demonstrated. Our approach was to make a high resolution study encompassing two main lines of evidence: imaging and elemental analysis. We have studied three stages of the nacre formation process using a gastropod species as model system. Gastropod peculiarity is the presence of a dense organic membrane (the surface membrane), which covers the mineralization compartment. Within such compartment, the organic membranes (interlamellar membranes) are arranged first and the mineral forms between them. The gastropod nacre tablets stack forming towers.
This PhD study is divided in three sections: - Determination of the transport mechanism of the ACC: vesicles function and surface membrane dynamics.
- Characterization of the ACC in the forming tablets (distribution and relationships with the crystalline phase).
- Study of the morphology in the mature tablet (nanogranularity).
For the first section we have used transmission electron microscopy (TEM) and electron energy loss spectroscopy (EELS). We have imaged and analysed the vesicles segregated by the mantle cells and the surface membrane. The results show that some of these vesicles transport calcium-rich material attached to their inner surface; the membranes of these vesicles also contain calcium. The surface membrane and the interlamellar membranes show certain amount of calcium. The surface membrane undergoes a structure modification process, from a fuzzy aspect looking towards the mantle cells, to a defined porous structure at the mineralization compartment side. When the interlamellar membranes detach from the surface membrane the porous structure is evident.
For the second section, about the transformation and crystallization of ACC, the amorphous phase has been imaged by means of TEM/STEM. The forming tablets are composed by an aggregation of globular particles (20-50 nm) that present a crystalline core (~ 30 nm average size) embedded in amorphous matrix (5-10 nm thickness). This amorphous layer presents a mixture of organic material and ACC, both identified by EELS. The crystalline nanodomains present complex, pseudodendritic forms, which might be connected in the third dimension.
The third section of this PhD study is dedicated to the study of the lineations in the surface of the nacre tablets. It was carried out by scanning electron microscopy (SEM), electron backscattered diffraction (EBSD) and atomic force microscopy (AFM). Images clearly show that lineations are the result of the aggregation of calcium carbonate nanoglobules. EBSD maps show that the lineations are aligned with the a-axis of the tablets. Our model proposes that this morphology results from the differential absorption of macromolecules along the aragonite crystallographic axes.
Finally, it is interesting to note that the results of the two latter sections match well, reinforcing our hypothesis that the nanogranular pattern characteristic of biominerals might not represent the aggregation unit sizes as was implied by some authors, but are the result of the subsequent crystallization process.
