Identificación de nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas anti-plaquetarias en infarto agudo de miocardio
- Autores: Paula Vélez Viéitez
- Directores de la Tesis: A. García Alcántara (dir. tes.), José María García Acuña (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidade de Santiago de Compostela ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Rivera Pozo (presid.), Pilar Mazón Ramos (secret.), Gloria Álvarez Llamas (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: MINERVA
- Resumen
Las plaquetas son pequeños fragmentos celulares que circulan por el torrente sanguíneo desempeñando numerosas funciones, la principal de ellas el mantenimiento de la hemostasia primaria, pero además están implicadas numerosos procesos patológicos entre los que destacan los síndromes coronarios agudos (SCAs). El infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST) es la forma más severa de SCA, y continúa siendo hoy en día uno de los problemas de salud más relevante de los países desarrollados. Cuando en una placa de ateroma vulnerable se produce una lesión, los componentes protrombóticos de la placa se exponen a la luz del vaso y promueven la activación plaquetaria que lleva a la formación de un trombo en el lugar de la lesión, originando una isquemia que puede ocasionar necrosis. Las plaquetas adheridas al trombo liberan microvesículas (MVs) con actividad proinflamatoria y protrombótica.
Las MVs son fragmentos citoplasmáticos rodeados de membrana liberados a la circulación sanguínea por parte de células activadas, fundamentalmente plaquetas, y representan una forma importante de comunicación intercelular. Se sabe que su número se encuentra elevado en el plasma de pacientes con SCA y que durante un infarto son reclutadas al lugar de la lesión inflamatoria desempeñando un papel importante en la modulación de la aterotrombosis. Por todo ello, uno de los objetivos planteados en esta tesis ha sido el estudio del proteoma de las MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST con el fin de proporcionar información novedosa sobre proteínas que pudieran estar jugando un papel relevante en los eventos fisiopatológicos que subyacen al evento agudo, y que pudieran servir como biomarcadores o dianas terapéuticas para la enfermedad. El análisis proteómico comparativo de MVs del plasma de pacientes con IAMCEST y controles con cardiopatía isquémica crónica estable (CROIAMCEST) se realizó mediante electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE), revelando la existencia de 117 diferencias significativas correspondientes con 25 proteínas únicas. El análisis de biología de sistemas reveló que la mayoría de las proteínas identificadas estaban relacionadas con respuesta inflamatoria, trombosis y enfermedad cardiovascular. Once de estas proteínas se encuentran en redes relacionadas con infarto y 10 en redes relacionadas con aterosclerosis. Además, es importante destacar que varias de las proteínas identificadas están involucradas en la trombogénesis, lo que indica que las MVs pueden estar jugando un papel relevante a nivel local en los eventos aterotrombóticos que conducen a un infarto de miocardio. Los estudios de validación se centraron en dos proteínas con isoformas altamente representadas en el análisis proteómico y con interés potencial como biomarcadores para el IAMCEST: A2MG y fibrinógeno. Además, se validó la viperina (RSAD2) por su potencial interés.
La falta de núcleo de las plaquetas las convierte en candidatas ideales para estudios proteómicos. Nuestro grupo analizó recientemente el proteoma de las plaquetas procedentes de sangre venosa de pacientes con SCA, con especial énfasis en pacientes con IAMCEST, evidenciando que el proteoma plaquetario se ve alterado durante el evento agudo. Con el fin de ampliar el conocimiento sobre la fisiopatología del infarto e identificar proteínas alteradas que pudieran servir como posibles biomarcadores o dianas terapéuticas, nos propusimos analizar el proteoma de las plaquetas procedentes de sangre arterial del lugar de la oclusión (en contacto con el trombo) ya que pensamos que podrían reflejar fielmente lo que sucede durante el infarto. Para ello realizamos un estudio proteómico comparativo mediante 2D-DIGE utilizando plaquetas de pacientes IMACEST procedentes de sangre arterial en contacto con el trombo y plaquetas procedentes de sangre arterial periférica de los mismos pacientes. Dicho análisis reveló la existencia de 16 diferencias significativas correspondientes con 15 proteínas únicas, en su mayoría relacionadas con el citoesqueleto y funciones de transducción de señales. Se demostró la sobre-regulación de la integrina αIIb (ITA2B), y de la Src kinase-associated phosphoprotein 2 (SKAP2) en plaquetas procedentes de sangre de la arteria coronaria ocluida. Estos resultados apuntan hacia vías de activación donde estas proteínas están implicadas como posibles dianas terapéuticas antiplaquetarias en IAMCEST.
Los resultados de los estudios proteómicos realizados por nuestro grupo en plaquetas de pacientes con IAMCEST (incluyendo el realizado en esta tesis) sugieren una participación directa de la vía de del receptor de colágeno específico de plaquetas, la glicoproteína VI (GPVI), en el evento agudo. En los últimos años se ha propuesto firmemente al receptor plaquetario GPVI como un biomarcador útil para la detección temprana de isquemia miocárdica ya que su expresión se ha demostrado aumentada en pacientes con SCA. Todo ello ha dirigido nuestros esfuerzos al estudio en profundidad de este receptor y de su vía de activación, siendo otro de los temas principales de esta tesis doctoral. Inicialmente analizamos el estado de activación de la vía de señalización de GPVI en plaquetas obtenidas a partir de sangre venosa de pacientes con IAMCEST para confirmar su estado de activación, utilizando como grupo control pacientes CROIAMCEST. Como la vía de GPVI funciona a través de fosforilaciones en tirosina (pTyr) de las proteínas que la conforman, el análisis proteómico se basó en inmunoprecipitaciones de las proteínas pTyr tras la estimulación plaquetaria con el agonista especifico de GPVI, collagen-related peptide (CRP). Las inmunoprecipitaciones se resolvieron por electroforesis monodimensional. De entre las proteínas identificadas por proteómica como diferencialmente reguladas se seleccionaron cuatro pertenecientes a la vía de señalización de GPVI para su validación: PLCγ2, SLP76, Dok-2 y G6F. Tras validar los niveles de las formas pTyr de las cuatro proteínas seleccionadas utilizando plaquetas procedentes de sangre venosa en un grupo independiente de pacientes, seguimos la misma estrategia utilizando plaquetas procedentes de sangre arterial en contacto directo con el trombo con el fin de determinar si presentan mayores niveles de activación de la vía que aquellas alejadas del lugar de la oclusión. Los resultados revelaron que la vía de señalización de GPVI se encuentra sobreactivada en pacientes con IAMCEST, y que las plaquetas en contacto directo con el trombo presentan mayores niveles de activación dicha vía que aquellas alejadas del lugar del daño. Además realizamos un estudio piloto de agregación que reveló que la agregación plaquetaria inducida por la activación de GPVI es mayor en pacientes con IAMCEST.
Se ha descrito que GPVI es crítico para la formación de trombosis arterial pero no para la hemostasia normal. Además, diversos estudios han demostrado que su expresión en la superficie plaquetaria se encuentra elevada en pacientes con SCA. Con esto en mente y teniendo en cuenta el papel relevante que juega el receptor GPVI en los SCAs, y más en concreto habiendo demostrado el papel clave que juega la activación de dicho receptor en el IAMCEST, no cabe duda de que su inhibición podría suponer un gran avance en el tratamiento de estas enfermedades. Todo ello, junto con el hecho de que GPVI se expresa solamente en las plaquetas y megacariocitos, ha hecho de este receptor una diana farmacológica antitrombótica prometedora para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Por este motivo una amplia sección de esta tesis aborda el estudio de la inhibición del receptor GPVI. Tras determinar mediante estudios de agregación que GPVI es el principal receptor responsable de la agregación inducida por colágeno, hemos abordado el estudio de la inhibición de dicho receptor. Por un lado hemos tratado de caracterizar el potencial inhibitorio que tiene el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal OM2 (cedido por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. (Japón)) sobre GPVI tanto a nivel de agregación como a nivel bioquímico. Por otro lado hemos estableciendo las bases para la identificación de pequeñas moléculas inhibidoras de GPVI para su uso como potenciales agentes antitrombóticos mediante técnicas de cribado de alto rendimiento (high-throughput screening, HTS).
