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Insights into the function and activity mechanism of stress-induced small non-coding RNAs and the endoribonuclease ybey in the legume symbiont sinorhizobium meliloti

  • Autores: Alexandra Peregrina Lavín
  • Directores de la Tesis: José Lgnacio Jiménez Zurdo (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2017
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Rafael Rivilla Palma (presid.), Jose Antonio Herrera Cervera (secret.), José María Vinardell González (voc.), Cecília M. Arraiano (voc.), María Trinidad Gallegos Fernández (voc.)
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
  • Resumen
    • RESUMEN INTRODUCCIÓN/OBJETIVOS Algunas especies de α-proteobacterias del orden Rhizobiales (conocidas colectivamente como rizobios) son capaces de establecer simbiosis fijadoras de nitrógeno con plantas le-guminosas. La simbiosis culmina con la formación de un nuevo órgano en las raíces de las leguminosas, el nódulo, donde las bacterias simbióticas experimentan una diferenciación morfológica a bacteroides maduros, que reducen el dinitrógeno atmosférico a amonio me-diante el complejo de la nitrogenasa (Limpens et al., 2005; Oldroyd and Downie, 2008). Durante la interacción simbiótica, los rizobios cambian de un estado de vida libre en el suelo a un estado intracelular dentro de los nódulos radiculares. Esta compleja transición requiere que los rizobios se adapten rápidamente a ambientes cambiantes, influidos tanto por los factores abióticos (fase de vida libre) como por las señales de las plantas (estadio endosimbiótico). A nivel molecular, estas respuestas adaptativas requieren la activación de complejas redes reguladoras de genes (Oldroyd and Downie, 2008), muchas de las cuales están escasamente caracterizadas.

      La investigación post-genómica ha revelado una inesperada abundancia y diversidad de pequeñas moléculas de RNA que no se traducen a proteínas, pero tienen funciones regula-doras muy importantes en procariotas, eucariotas y arqueas (Storz et al., 2005). En bacte-rias, estos RNAs (50-350 nt) son genéricamente conocidos como pequeños RNAs no-codificantes (sRNAs). Los sRNAs bacterianos están implicados en la regulación génica post-transcripcional (riboregulación) a través de la interacción con proteínas específicas o, más comúnmente, con secuencias complementarias localizadas en las regiones 5 'UTR (región no traducida) de mRNA codificados en trans (Majdalani et al., 2005). Esta com-plementariedad es a menudo imperfecta e implica series cortas y discontinuas de nucleóti-dos en ambas moléculas. Estos eventos reguladores requieren la actividad de proteínas como la chaperona de RNA Hfq (Valentin-Hansen et al., 2004; Vogel and Luisi, 2011) o ribonucleasas (RNasas), como la RNasa III o RNasa E (Lamontagne and Elela, 2004; Vo-gel et al., 2004; Viegas and Arraiano, 2008). La interacción sRNA-mRNA tiene general-mente un efecto negativo sobre la traducción/estabilidad del mRNA, pero se conocen casos de inducción de la traducción mediada por sRNAs. La riboregulación afecta a diversos procesos como la adaptación al estrés abiótico, el quorum sensing y la virulencia (Vogel, 2009). Estas evidencias anticipan que los sRNAs rizobiales pueden tener funciones muy importantes en la coordinación de las respuestas de estas bacterias a diferentes estímulos externos durante la interacción simbiótica.

      Estudios recientes a nivel de RNomas no codificantes de la bacteria endosimbiotica de alfalfa Sinorhizobium meliloti han revelado grandes catálogos de sRNAs que incluyen cen-tenares de supuestos trans-riboreguladores (del Val et al., 2007, 2012; Ulvé et al., 2007b; Valverde et al., 2008; Schlüter et al., 2010, 2013), cuyas funciones no están todavía carac-terizadas. Teniendo en cuenta estos antecedentes los objetivos de este trabajo de investiga-ción fueron:

      1. Profundizar en la regulación transcripcional y el potencial de interacción con sus men-sajeros diana del sRNA AbcR2 inducido por estrés.

      2. Adquirir conocimientos básicos sobre la función de un nuevo sRNA, todavía no carac-terizado, denominado NfeR1.

      3. Explorar la participación en la riboregulación de una proteína casi ubicua en bacterias denominada YbeY.

      METODOLOGÍA/RESULTADOS Además de la posible interacción con las proteínas celulares, la caracterización funcional de los trans-sRNAs debe abordar su estructura y filogenia, su patrón de expresión y fenotipos relacionados, así como la identificación de sus mRNA diana. En este trabajo, hemos contribuido a descifrar la función de los trans-sRNAs de S. meliloti AbcR2 y NfeR1, pre-viamente identificados y validados en nuestro grupo de investigación mediante la combi-nación de varias técnicas in silico con hibridaciones Northern (Valverde et al., 2008; Jimé-nez-Zurdo et al., 2013).

      Estudios previos catalogaron AbcR2 como miembro de la familia αr15 de sRNAs en las α-proteobacterias (Torres-Quesada et al., 2013). En S. meliloti Rm1021, los transcritos AbcR2 y AbcR1 codificados en tándem exhiben un perfil de expresión diferencial, lo que sugiere funciones y regulaciones independientes (Torres-Quesada et al., 2013). De acuerdo con esto, nuestro análisis in silico de las regiones promotoras de abcR1/2 sugirió la regulación diferencial de los genes correspondientes, mientras que nuestros experimentos de Northern blot también revelaron que la transcripción de abcR2 depende del factor σ alternativo de la RNA polimerasa RpoH1. En este trabajo, validamos in vivo el control traduccional mediado por AbcR2 de los mensajeros SMa0495 y prbA, ambos codificantes de proteínas periplásmicas de sistemas de transporte ABC de aminoácidos, previamente identificados en las librerías de transcritos que co-inmunoprecipitan con Hfq (CoIP-RNA) (Torres-Quesada et al., 2014). Las predicciones in silico sugirieron que la regulación negativa de la traducción de prbA involucra la interacción éste con una secuencia nucleotídica anti Shine Dalgarno (aSD) que permanece desapareada en la primera horquilla de AbcR2 (M1). Por el contrario, en la regulación de SMa0495 participa un segundo motivo aSD localizado entre las dos primeras horquillas predichas en AbcR2 (M2). La regulación de ambos mRNAs por AbcR2 fue confirmada experimentalmente.

      Los alineamientos iniciales del trans-sRNA NfeR1 con su grupo de homólogos identifica-dos mediante BLASTN, la definición subsecuente de su modelo de covarianza (CM) y su estructura secundaria consenso, catalogaron este sRNA como miembro de la familia αr14 en las α-proteobacterias. NfeR1 fue agrupado en esta familia junto con sus homólogos de las especies filogenéticamente más cercanas a S. meliloti, incluyendo miembros de las fa-milias Rhizobiaceae, Brucellaceae y Phyllobacteriaceae. El CM de la familia αr14 también predijo 5 copias adicionales al gen que codifica NfeR1 en el genoma de S. meliloti Rm1021, aunque el transcrito de 123 nt codificado en el cromosoma fue la única copia cuya expresión fue detectada en nuestro análisis experimental. Igualmente, observamos que NfeR1 es indispensable para el crecimiento en vida libre de S. meliloti a alta concentración de sal, además de que es necesario para la expresión de genes funcionalmente relacionados con la adaptación a estrés, el catabolismo de osmolitos y el transporte a través de membrana en condiciones de estrés osmótico. Asimismo, este sRNA se requiere para el establecimiento de una simbiosis eficiente con su leguminosa huésped, contribuyendo a la nodulación, competitividad, infectividad, desarrollo del nódulo y eficiencia simbiótica glo-bal de S. meliloti. La determinación del perfil de expresión de NfeR1 reveló que su trans-cripción es dependiente de un factor sigma RpoD, pero es potenciada por un motivo con-servado en las regiones promotoras de sus homólogos en las α-proteobacterias. Las predic-ciones de mensajeros diana de NfeR1 revelaron la existencia de interacciones típicas carac-terizadas por la complementariedad imperfecta y discontinua de las secuencias de nucleó-tidos cerca del sitio Shine-Dalgarno en el mRNA, e involucrando a los tres aSDs del sRNA de una manera redundante. Los mRNA diana predichos para NfeR1 codifican mayorita-riamente transportadores ABC de afinidad por sustratos diversos.

      Para identificar proteínas potencialmente involucradas en la actividad de AbcR2 y NfeR1, consideramos YbeY (SmYbeY) debido a su homología estructural con el dominio MID de la proteína Argonauta que media el silenciamiento por RNA en eucariotas y por su pro-puesta relación funcional con Hfq (Pandey et al., 2011). Sin embargo, los resultados aquí mostrados revelaron que SmYbeY es realmente una endoribonucleasa y no una chaperona de RNA del tipo Hfq (Saramago et al., 2017). Nuestro análisis transcriptómico reveló una escasa influencia de SmYbeY en la expresión y estabilidad de trans-sRNAs. Sin embargo, entre los transcritos negativamente regulados en el mutante SmYbeY, identificamos algu-nos que pueden ser sustratos de esta RNasa. Entre ellos cabe destacar livK y prbA, ambos diana de AbcR1/2, así como nifA, que codifica el activador transcripcional de los genes estructurales de la nitrogenasa, al que está asociado un RNA antisentido (asRNA) (Torres-Quesada et al., 2013; Sobrero & Valverde, 2012a; Wilms et al., 2011; Caswell et al., 2012; Overlöper et al., 2014). SmYbeY estaría, por tanto, involucrada en el silenciamiento post-transcripcional de estos mRNAs promovido por su interacción con sRNAs.

      CONCLUSIONES 1. La transcripción del sRNA AbcR2 dependiente de Hfq e inducido por estrés depende del factor σ alternativo de la RNA polimerasa RpoH1.

      2. El catálogo de RNAs que interaccionan con Hfq es una fuente fiable para la identifica-ción de las parejas reguladoras sRNA-mRNA en S. meliloti. Como prueba de ello, se confirmó la regulación por AbcR2 de prbA y SMa0495, ambos codificantes de trans-portadores de aminoácidos. AbcR2 regula negativamente estos mRNAs por un meca-nismo canónico que implica interacciones de pares de bases en la región de iniciación de la traducción con cualquiera de los dos motivos aSD desapareados dentro del sRNA, que podrían tener una función discriminatoria para la regulación de grupos distintos de mRNAs.

      3. El sRNA NfeR1 de S. meliloti está muy conservado en especies de las familias Rhizo-biaceae, Brucellaceae y Phyllobacteriaceae dentro del subgrupo α de las proteobacte-rias, integrando la familia de sRNAs conocida como αr14. La cepa de referencia Rm1021 de S. meliloti codifica seis homólogos de este sRNA pero sólo la copia cromo-sómica de 123 nt fue detectada mediante hibridación por Northern.

      4. La expresión de NfeR1 se induce en respuesta al estrés salino y a lo largo de la interac-ción simbiótica de S. meliloti con alfalfa. La fuerza y la regulación diferencial de la transcripción de nfeR1 están conferidas por un motivo que se encuentra conservado en las regiones promotoras de sus homólogos en las α-proteobacterias.

      5. NfeR1 influye positivamente en la osmoadaptación de las bacterias en vida libre y es necesario para la expresión de una serie de genes sensibles a la sal relacionados con la adaptación al estrés, el catabolismo de osmolitos y el transporte a través de la membrana celular. En simbiosis, NfeR1 contribuye a la competitividad por la nodulación, in-fectividad, desarrollo de nódulos y la eficiencia simbiótica general de S. meliloti en las raíces de alfalfa. El perfil de expresión de NfeR1 y sus fenotipos asociados proporcio-nan una evidencia genética de las condiciones hiperosmóticas, aún no demostradas, de los compartimentos endosimbióticos.

      6. Las predicciones in silico basadas en genómica comparada anticipan un papel redun-dante de tres motivos aSD de NfeR1 para la regulación de múltiples mRNAs que codi-fican transportadores ABC con preferencia por diversos substratos. Esta hipótesis ha sido posteriormente confirmada experimentalmente.

      7. El proteoma dependiente de AbcR2 y NfeR1 identificó múltiples mRNAs de genes de transportadores ABC como posibles dianas de estos sRNAs, además de apoyar la hipó-tesis de que AbcR2, su homólogo AbcR1, y NfeR1 gobiernan un amplio regulón con muchas dianas comunes para el control de la adquisición de nutrientes en respuesta a diferentes señales medioambientales. La actividad reguladora de estos sRNAs contri-buiría a coordinar el transporte de nutrientes con la reprogramación metabólica durante la interacción simbiótica.

      8. SmYbeY no tiene un papel como proteína estabilizadora del RNA similar Hfq. Sin em-bargo, actúa como enzima silenciadora cuya actividad tiene gran influencia en las fun-ciones celulares fundamentales codificadas en el cromosoma, así como en ciertas vías adquiridas codificadas en los plásmidos simbióticos de S. meliloti.

      9. Los regulones de Hfq y SmYbeY son muy diferentes. Sin embargo, su comparación reveló una serie de posibles sustratos de la RNasa SmYbeY. En particular, SmYbeY podría ser el enzima responsable del inicio de la degradación de mRNAs de transporte o fijación de nitrógeno, regulados por AbcR2 o por asRNAs todavía no caracterizados, respectivamente.

      SUMMARY INTRODUCTION/OBJECTIVES Some species of α-proteobacteria of the order Rhizobiales (collectively known as rhizobia) are able to establish nitrogen-fixing symbiosis with leguminous plants. The symbiosis culminates with the formation of a new organ on the roots of legumes, the nodule, where the symbiotic bacteria undergo a morphological differentiation to mature bacteroids, which reduce the atmospheric dinitrogen to ammonia by the nitrogenase complex (Limpens et al., 2005; Oldroyd and Downie, 2008). During the symbiotic interaction, rhizobia switch from a free-living state in soil to an intracellular state within root nodules. This complex transition requires rhizobia to adapt to rapidly changing environments, influenced by both abiotic factors (free-living phase) and plant signals (endosymbiotic life stage). At the molecular level, these adaptive responses require the activation of intricate gene regulatory networks (Oldroyd and Downie, 2008), most of which are poorly characterized.

      Post-genomic research has revealed an unexpected abundance and diversity of small RNA molecules that are not translated into proteins, but have very important regulatory functions in prokaryotes, eukaryotes and archaea (Storz et al., 2005). In bacteria, these RNAs (50-350 nt) are generically known as non-coding sRNAs (small RNAs). Bacterial sRNAs are involved in post-transcriptional gene regulation (riboregulation) through interaction with specific proteins or, more commonly, with complementary sequences located within 5'-UTR regions (untranslated region) of trans-encoded mRNAs (Majdalani et al., 2005). This complementarity is often imperfect and involves short and discontinuous series of nucleotides in both molecules. Remarkably, these regulatory events are commonly influenced by RNA chaperones, such as the well-known Hfq (in bacteria encoding a recognizable homolog of the protein) (Valentin-Hansen et al., 2004; Vogel and Luisi, 2011), or ribonucleases (RNases), such as RNase III or RNase E (Lamontagne and Elela, 2004; Vogel et al., 2004; Viegas and Arraiano, 2008). The sRNA-mRNA interaction commonly has a negative effect on translation/stability of the mRNA, but several cases of sRNA-mediated translational induction have been reported. Riboregulation impacts diverse processes, such as adaptation to abiotic stresses, quorum sensing and virulence (Vogel, 2009). These evidences anticipate that rhizobial sRNAs may have very important functions in coordinating the responses of these bacteria to different external stimuli during the symbiotic interaction.

      Recent systems-level surveys of the non-coding RNomes of the alfalfa endosymbiotic bacterium Sinorhizobium meliloti have delivered large sRNA catalogues that include hundreds of putative trans-acting riboregulators (del Val et al., 2007, 2012; Ulvé et al., 2007b; Valverde et al., 2008; Schlüter et al., 2010, 2013), whose functions remain to be characterized.

      The objectives of this research work were:

      1. To deepen into the transcriptional regulation and targeting potential of the stress-induced AbcR2 sRNA.

      2. To gain primary insights into the function of a novel, yet uncharacterized sRNA referred to as NfeR1.

      3. To explore the involvement in riboregulation of the conserved bacterial YbeY protein.

      METHODOLOGY/RESULTS In addition to the possible interaction with cellular proteins, functional characterization of trans-sRNAs should address their structure and phylogeny, their expression pattern and related phenotypes, as well as the identification of their target mRNAs. In this work, we have contributed to the function deciphering of the S. meliloti AbcR2 and NfeR1 trans-acting sRNAs, previously identified and validated in our group by combining several computational approaches with Northern blot hybridizations (Valverde et al., 2008; Jiménez-Zurdo et al., 2013).

      Previous studies have shown AbcR2 to be a member of the multicopy αr15 family of α-proteobacterial trans-sRNAs (Reinkensmeier et al., 2011; del Val et al., 2012), Hfq-dependent and stress-induced (Torres-Quesada et al., 2013). In S. meliloti Rm1021, tandemly-encoded AbcR2 and AbcR1 transcripts exhibit a divergent unrelated expression profile, suggesting independent functions and regulations (Torres-Quesada et al., 2013). According to this, our in silico analysis of the abcR1/2 promoter regions suggested a differential regulation of the corresponding genes, while our Northern blot experiments also revealed the dependence of abcR2 transcription on the alternative RNA polymerase sigma factor RpoH1. In this work, we validated the AbcR2-mediated translational control of the SMa0495 and prbA mRNAs in vivo, both coding for periplasmic amino acid-binding proteins of ABC transport systems and previously identified in Hfq CoIP-RNA (Torres-Quesada et al., 2014). Computational predictions suggested that downregulation of prbA translation involves its interaction with an anti-Shine Dalgarno (aSD) sequence that remains single-stranded in the first hairpin of AbcR2 (M2). Conversely, regulation of SMa0495 involves a second unpaired aSD motif (M2) located between the two first hairpins of the sRNA. These predictions were further confirmed experimentally.

      The initial alignments of the trans-encoded NfeR1 sRNA with its group of homologs identified by BLASTN, the subsequent definition of its covariance model (CM) and its secondary consensus structure, have revealed this sRNA as a member of the multicopy αr14 family in α-proteobacteria. NfeR1 was grouped in this family together with its homologs from the phylogenetically closest species of S. meliloti, including members of the Rhizobiaceae, Brucellaceae and Phyllobacteriaceae families. The αr14 CM also identified up to five additional predicted copies of the query NfeR1-encoding gene in the S. meliloti Rm1021 genome, although the chromosomally encoded 123-nt long NfeR1 transcript was the only copy detected in our experimental analysis. Besides, NfeR1 was found to be dispensable for free-living growth of S. meliloti in high-salinity minimal medium, whereas it is required for the expression of genes involved in stress adaptation, osmolyte catabolism and membrane trafficking in osmotic stress conditions. Likewise, this sRNA is required for the establishment of an efficient symbiosis with its cognate legume host alfalfa under laboratory conditions, contributing to nodulation competitiveness, infectivity, nodule development and global symbiotic efficiency. The determination of the NfeR1 expression profile revealed nfeR1 transcription to be dependent on sigma factor RpoD, and enhanced by a conserved motif in the promoter regions of α–proteobacterial homologs. The genome-based prediction analysis of target mRNAs of NfeR1 revealed the existence of typical interactions characterized by imperfect and discontinuous complementarity of the nucleotide sequences near the Shine-Dalgarno site in the mRNA, and involving the three aSDs of the sRNA in an unprecedented redundant way. The predicted target mRNAs of NfeR1 indicated a massive regulation of ABC transporters by this sRNA.

      In order to identify alternative protein factors involved in the activity of our studied sRNAs, the YbeY (SmYbeY) protein was considered promising due to its structural homology with the MID domain of the Argonaute eukaryote protein involved in RNA-mediated silencing and its proposed functional relationship with Hfq (Pandey et al., 2011). However, the results presented in this work have contributed to expose that SmYbeY is rather an endoribonuclease than an Hfq-like RNA chaperone (Saramago et al., 2017). Our transcriptomics data uncovered a scarce influence of SmYbeY on the steady-state levels of trans-sRNAs. However, among the transcripts upregulated in the SmYbeY mutant, we found a number of putative substrates of this endoribonuclease. Thes incluse the mRNAs livK and prbA, both targets of AbcR1/2, as well as nifA, encoding the transcriptional activator of the structural genes of nitrogenase to which a yet uncraracterized antisense sRNA (asRNA) is associated (Torres-Quesada et al., 2013; Sobrero & Valverde, 2012a; Wilms et al., 2011; Caswell et al., 2012; Overlöper et al., 2014). Thus, SmYbeY would mediate silencing of these mRNAs upon antisense interaction with their corresponding sRNA partners.

      CONCLUSIONS 1. Transcription of the stress-induced Hfq-dependent AbcR2 sRNA is driven by the alternative RNA polymerase sigma factor RpoH1.

      2. The catalog of Hfq-binding RNA species is a reliable resource for the identification of sRNA-mRNA regulatory pairs in S. meliloti. As a proof of principle, AbcR2 targeting of the Hfq-bound amino acid transporter mRNAs prbA and SMa0495 was confirmed. AbcR2 most likely downregulates these mRNAs by a canonical mechanism involving base-pairing interactions at the translation initiation region with either of the two unpaired anti-Shine-Dalgarno (aSD) motifs within the sRNA, which may serve a discriminatory function for targeting.

      3. The S. meliloti NfeR1 sRNA is widely conserved in species of the Rhizobiaceae, Brucellaceae and Phyllobacteriaceae families within the large α–subgroup of proteobacteria, integrating the so-called αr14 family of sRNAs. The S. meliloti reference strain Rm1021 encodes six αr14 homologs but only the chromosomal 123-nt long NfeR1 transcript was reliably detected by Northern hybridization.

      4. Expression of NfeR1 is induced in response to salt stress and throughout the symbiotic interaction of S. meliloti with alfalfa. The strength and differential regulation of nfeR1 transcription are conferred by a motif, which is conserved in the promoter regions of its α–proteobacterial homologs.

      5. NfeR1 positively influences osmoadaptation of free-living bacteria and is required for wild-type expression of an array of salt-responsive genes related to stress adaptation, osmolyte catabolism and membrane trafficking. In symbiosis, NfeR1 contributes to nodulation competitiveness, infectivity, nodule development and overall symbiotic efficiency of S. meliloti on alfalfa roots. The NfeR1 expression profile and its associated phenotypes provide genetic evidence of the yet undemonstrated hyperosmotic conditions of the endosymbiotic compartments.

      6. Comparative computer predictions anticipated a redundant role of three identical NfeR1 unpaired aSD motifs for targeting of multiple mRNAs encoding ABC transporters with diverse substrate preference. This hypothesis has been later confirmed experimentally.

      7. AbcR2- and NfeR1-dependent periplasmic proteomes identified multiple mRNAs from ABC transporter genes as additional putative targets of these sRNAs, thus supporting the hypothesis that AbcR2, its homolog AbcR1 and NfeR1 govern a large dense overlapping regulon for the control of nutrient uptake in response to different environmental signals. The regulatory activity of these sRNAs would contribute to coordinate nutrient uptake with the metabolic reprogramming concomitant to symbiotic transitions.

      8. SmYbeY does not serve an Hfq-like role as RNA stabilizer and matchmaker in riboregulation. Rather, YbeY acts as a silencing enzyme whose activity profoundly impacts on conserved fundamental chromosomally-encoded functions as well as on certain acquired plasmid-encoded S. meliloti pathways.

      9. There is a discrete overlap between the Hfq and YbeY regulons. However, the comparison of the Hfq and YbeY RNA networks unveiled a number of putative substrates of this RNase. In particular, YbeY endoribonuclease activity could initiate decay of Hfq-binding transporter and nitrogen-fixation mRNAs upon their base-pairing interaction with the AbcR2 trans-sRNA and asRNAs, respectively.

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      Director/es de la Tesis / Thesis supervisor/s: Doctorando / Doctoral candidate: Fdo. José I. Jiménez Zurdo Fdo. Alexandra Peregrina Lavín


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