Development of Pichia pastoris for the production of human α-galactosidase A as a model lysosomal enzyme

• Autores: Antonio Barreiro Vázquez
• Directores de la Tesis: David Resina Rodríguez (dir. tes.), Pau Ferrer Alegre (tut. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2016
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: José V. Colchero (presid.), Xavier Turon Casalprim (secret.), Jordi Xavier Feliu Gil (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TESEO  TDX  DDD 
• Resumen

  • L’?-galactosidasa A humana (GLA) pertany a la família d’hidrolases lisosomals involucrades en malalties d’emmagatzemat enzimàtic (MEEs). Les teràpies de reemplaçament enzimàtic (TREs), basades en l’administració de l’enzim disfuncional, són una mesura eficient per alentir l’avanç d’algunes MEEs. Tanmateix, el cost de les TREs disponibles actualment es extremadament elevat. Per tant, es proposa com a solució l’ús de sistemes de producció alternatius. P. pastoris és un sistema prometedor per la producció de productes terapèutic biològics, tot i que el seu patró de glicosilació ha de ser adaptat per a aquest ús. GLA, involucrat en la malaltia de Fabry, és l’enzim seleccionat per Bioingenium per avaluar la viabilitat del llevat per produir hidrolases lisosomals, i en tal cas, per al seu ús com a proteïna model per a la modificació del patró de glicosilació P. pastoris. En primer lloc, es va avaluar l’expressió GLA recombinant (rhGLA) en diferents soques de P. pastoris. Un cop seleccionada la més adient, els nivells d’expressió és van millorar mitjançant la sobreexpressió de HAC1p, un activador transcripcional. A continuació, es va optimitzar la productivitat específica de rhGLA mitjançant el clonatge de múltiples còpies del gen codificant. En conjunt, es va aconseguir millorar 7 vegades la productivitat comparat amb els valors inicials. Addicionalment, es van expressar amb èxit variants de l’enzim amb tag, amb un domini d’internalització cel·lular, o mancat d’una seqüència C-terminal. En darrer lloc, es va obtenir un clon lliure de marcadors de resistència per al seu ús com a soca base per la modificació del patró de glicosilació. Es va establir un procés escalable de producció en bioreactor basat en condicions d’O2 limitant, permetent la producció d’elevades quantitats d’enzim. A més, es van desenvolupar mètodes cromatogràfics per a l’aïllament de rhGLA. En concret, s’ha descrit un procés basat en 3 passos cromatogràfics per la purificació de quantitats significants d’enzim lliure de tag, així com procediments de cromatografia d’afinitat per la purificació de petites quantitats de variants de rhGLA destinades a ser caracteritzades. Finalment, s’ha implementat un conjunt de tècniques per la caracterització de l’enzim, incloent anàlisis de glicans i assajos in vitro. Mitjançant l’ús de fibroblasts provinents d’un pacient de Fabry, s’ha pogut valorar amb simplicitat la eficiència d’internalització de l’enzim recombinant. Tal i com s’esperava, la rhGLA amb estructures de glicosilació pròpies de llevat va mostrar nivells d’internalització pobres. En general, s’ha demostrat que P. pastoris és un sistema d’expressió adequat per a la producció de rhGLA. Els mètodes desenvolupats en aquest treball són de gran valor per futures investigacions relacionades amb la humanització dels patrons de glicosilació de P. pastoris. A més, els resultats són d’utilitat per l’escalat dels processos de producció, que habilitaran el llevat per la producció de diferents enzims lisosomals destinats a l’ús en TREs.