Mejora de la tolerancia a salinidad en patrones de cítricos. Desarrollo de herramientas biotecnológicas para citrus reshni
- Autores: Maria Veronica Raga Gratacos
- Directores de la Tesis: María José Asins Cebrián (dir. tes.), Guillermo Pablo Bernet Zamanillo (codir. tes.), Ramón Serrano Salom (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat Politècnica de València ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Vicente Moreno (presid.), José Gadea Vacas (secret.), Andres Belver Cano (voc.), María del Carmen Bolarín Jiménez (voc.), María Asunción Martínez Mayoral (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Pese a la importancia económica que tienen los cítricos a nivel mundial, el desarrollo de programas de mejora genética ha sido lento, generándose escasas variedades y menos aún, patrones de interés comercial bien adaptados a las condiciones edafo-climáticas particulares de cada región agraria. El área Mediterránea es una de las principales zonas productoras de cítricos del mundo, en ella más del 85% de los nuevos huertos de mandarinas y naranjas se encuentran injertados sobre patrón citrange Carrizo, lo cual deja al cultivo de cítricos muy vulnerable al efecto de variaciones, tanto en factores bióticos como abióticos. La condición de clima semiárido, unido a la presencia de suelos calcáreos y/o salinos y a la baja calidad de las aguas de riego ([Cl-] > 10mM), hacen que el problema de la salinidad sea una amenaza cada vez mayor para las plantaciones situadas próximas a la costa Mediterránea. Los cítricos son especies sensibles al exceso de sales, incluso a niveles moderados sufren alteraciones fisiológicas. La falta de estudios enfocados a la mejora genética de patrones de cítricos para tolerancia a salinidad se ha debido, por una parte, a la compleja naturaleza de la respuesta fisiológica de la planta frente a estrés salino y, por otra, a las limitaciones propias del cultivo de cítricos. Gracias al creciente desarrollo obtenido en el campo de la biotecnología durante las últimas décadas, se han conseguido avances importantes a través de la adopción de nuevas técnicas. En este sentido, el desarrollo de marcadores moleculares y de métodos estadísticos para la construcción de mapas genéticos de ligamiento, han sido la base para desarrollar estudios genéticos más avanzados que permitan localizar y estimar los efectos de los genes (QTLs) que controlan los caracteres cuantitativos a mejorar.
La necesidad de diversificación de patrones para la zona Mediterránea, con genotipos que confieran una mayor tolerancia a salinidad que citrange Carrizo, ha llevado a plantear como objetivos de esta tesis: 1. El estudio genético del comportamiento bajo tratamiento salino de dos poblaciones de patrones de cítricos, con el fin de conocer los caracteres que de mejor manera representen la tolerancia a salinidad; 2. El desarrollo de herramientas biotecnológicas que permitan agilizar las etapas de selección (MAS; selección asistida por marcadores), en programas de mejora de patrones de cítricos que utilicen el mandarino Cleopatra (C. reshni) como donante de la tolerancia a salinidad.
Los resultados de los estudios genéticos y fisiológicos llevados a cabo en la población injertada de patrones de cítricos (C. volkameriana x P. trifoliata; V x Pv) y en la población de patrones sin injertar (C. reshni x P. trifoliata; R x Pr), han confirmado la complejidad de la tolerancia al estrés salino, la cual deriva de la diversidad de variables vegetativas y productivas que se ven afectadas significativamente al incrementarse la salinidad, así como también del efecto de la salinidad sobre sus relaciones.
Al comparar ambas poblaciones se ha podido observar que en plantas injertadas el tratamiento salino (25 mM NaCl) parece afectar de forma similar a todos los genotipos, a excepción de unos pocos caracteres, mientras que en plantas sin injertar, además de un efecto significativo generalizado de la salinidad, la respuesta de los genotipos ha sido diferencial para todos los caracteres. En cuanto a la heredabilidad de los caracteres, los valores obtenidos han sido más elevados para la población sin injertar, lo cual parece razonable si se considera que en este caso se ha evaluado la contribución de la planta completa y no sólo la del sistema radical, de manera que habría más genes implicados.
El estudio de ambas poblaciones ha aportado una visión global más realista del comportamiento de los cítricos frente a incrementos en la salinidad, pudiendo seleccionar como mejores indicadores tempranos de tolerancia a estrés salino los siguientes caracteres: concentración de cloruro (Cl-) y de sodio (Na+) foliar; parámetros de color de hojas (LCb*, Cr*, LCL*, Hue*, ¿Eab*); área foliar (LAf); peso seco de hoja (LDWf); altura de planta (Hf) y diámetro de tronco (Df). Sólo los caracteres Cl- y Na+ foliar han mantenido su potencial para expresar tolerancia a salinidad tanto en patrones injertados como sin injertar. Los parámetros de color de hoja y los caracteres LAf y LDWf parecen estar más influenciados por la interacción patrón-injerto, mientras que los caracteres Hf y Df han mostrado una respuesta al tratamiento salino, pero la variación ha sido menor que la detectada para otros caracteres evaluados.
A partir de una población segregante proveniente del cruce entre C. reshni y P. trifoliata (R x Pr), se han construido los mapas genéticos de ligamiento para ambas especies. El uso de marcadores moleculares en común, específicos para cítricos (SSR, IRAP y SCAR), ha sido útil para comparar la organización lineal de ambos genomas, así como también los de otras especies de cítricos ya construidos con estos mismos marcadores. El porcentaje total de loci en heterocigosis obtenido, ha sido más bien bajo (alrededor de 40%), tanto en C. reshni como en P. trifoliata, lo cual representa una dificultad para la búsqueda de marcadores segregantes, especialmente en común. Esto ha llevado a construir un tercer mapa genético para una población segregante F2 de segunda generación (RPr). En cuanto al nivel de distorsión en la segregación de los marcadores, éste ha sido elevado en ambos parentales (C. reshni 42,7%, P. trifoliata 53,2%) independientemente del tipo de marcador, y la distorsión de origen gamético ha sido casi el doble que la de origen zigótico. Además, como parental masculino, la variedad F. Dragon aporta una mayor distorsión que Rich a la población y el factor que determina la distorsión segrega también entre familias F2.
La sintenia entre marcadores, en general se ha visto conservada entre los tres mapas genéticos obtenidos, a excepción de 3 loci donde se han producido inversiones entre marcadores adyacentes, posiblemente debido a su cercanía (< 2cM) y otros 2 puntos donde puede estar influyendo la presencia de distorsión en la segregación de los marcadores. Los mapas genéticos para C. reshni y P. trifoliata han sido construidos a partir de una población de 157 híbridos, con un total de 88 parejas de cebadores que revelan 132 loci polimórficos, el número de grupos de ligamiento obtenidos ha sido similar al número de cromosomas en cítricos (n=9) y las distancias medias entre marcadores adyacentes han sido cercanas a 10 cM, todo lo cual les otorga fiabilidad para ser utilizados como herramienta biotecnológica.
En base a los mapas genéticos obtenidos para C. reshni y P. trifoliata y a las medias genotípicas de los caracteres que fueron evaluados en la población R x Pr y seleccionados por su potencial para definir tolerancia a salinidad, se ha llevado a cabo el análisis de QTLs. Los marcadores moleculares significativamente asociados con cada carácter evaluado en condición control, salina y como diferencia entre ambas condiciones, han sido identificados mediante la prueba no paramétrica (marcador a marcador) de Kruskal-Wallis y el procedimiento de cartografiado por intervalo.
Para C. reshni se han obtenido 63 posibles QTLs, el 21% de ellos se ha detectado sólo en salinidad, 43% sólo en control y 19% tienen carácter constitutivo (se han detectado tanto en salinidad como en control). Para P. trifoliata en tanto, se han obtenido 21 posibles QTLs, el 24% de los cuales se ha detectado sólo en salinidad, 52% sólo en control y 10% en ambas condiciones. El total de QTLs significativos que se han detectado en C. reshni es casi tres veces mayor que el de P. trifoliata, lo cual estaría indicando que en esta especie hay más alelos que pueden contribuir a una mejor respuesta frente al estrés salino.
En general el número de QTLs detectados con elevada significación ha sido bajo y sólo algunos coinciden con marcadores para genes candidatos de tolerancia a salinidad incluidos en los mapas genéticos. Esto puede deberse en parte al reducido tamaño de la población utilizada en el análisis fenotípico (77 individuos), frente a la población genotipada (157 individuos), así como también a la falta de normalidad de las distribuciones de los caracteres estudiados, principalmente las de concentración de Cl- y Na+ foliar. A pesar de esto, se han identificado regiones de interés en los genomas de ambos parentales, capaces de aportar información útil sobre el fenómeno de tolerancia a salinidad y que serán consideradas para futuros estudios. También se han podido detectar QTLs comunes entre ambos parentales en los grupos de ligamiento 7 y 3, que pese a no tener una elevada significación, podrían corresponder a genes ortólogos.
Para P. trifoliata se ha localizado una única zona donde se detectan QTLs en salinidad relacionados con concentración de Cl- y Na+ foliar ubicada en el grupo de ligamiento Pr12. En el grupo Pr4b, en tanto, se han detectado QTLs en el cambio del estado de control a salinidad para parámetros de coloración foliar, en una zona donde ya se había descrito un QTL de gran efecto sobre la resistencia a CTV, señalando así una localización común en la respuesta a un estrés biótico y a otro abiótico.
Para C. reshni se han detectado dos zonas de interés en los grupos de ligamiento R8+6 y R12, donde coinciden QTLs para concentración de Cl- y Na+ foliar con QTLs para otros caracteres vegetativos de la planta. A partir de las medias genotípicas para los QTLs que colocalizan en el grupo R8+6, se ha podido deducir que la tolerancia a salinidad en la población R x Pr se basa en genotipos vigorosos, capaces de una mayor reducción del crecimiento vegetativo y de una menor concentración de Cl- y Na+ foliar, en respuesta al estrés salino.
