Immunological studies on Swine Influenza Virus in pigs: from gene to epitopes
- Autores: Massimiliano Baratelli
- Directores de la Tesis: María Montoya González (dir. tes.), Mercè Martí Ripoll (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2015
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Domínguez Juncal (presid.), Carme Roura Mir (secret.), Nicolas Bertho (voc.)
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- Resumen
El virus de la gripe porcina (VGP) es un patógeno importante en el sector veterinario con un gran potencial zoonótico, y por lo tanto se considera también una amenaza potencial para la salud pública. La vigilancia y el control de este patógeno en cerdos es por lo tanto crucial. Los métodos actuales de control se basan en la profilaxis, en particular, en vacunas que suscitan una respuesta de tipo humoral. La capacidad de escape y la alta variabilidad de VGP hacen que la eficacia de estas vacunas pueda verse comprometida; por tanto, deben ser actualizadas periódicamente. El mismo problema se plantea en la salud humana donde se están desarrollando vacunas diseñadas racionalmente con tal de solventarlo. Estas vacunas están siendo diseñadas para potenciar la respuesta de células T contra el virus de la gripe A (VGA). La respuesta de células T esta relacionada con la protección contra la infección por el VGA, centrándose en las proteínas internas y altamente conservadas del virus. Esto permitiría resolver los problemas anteriormente citados. Los epítopos de células T de VGP conocidos en cerdos son sólo unos pocos y están relacionados con el Complejo Mayor de Histocompatibilidad porcino de clase I (CMHpo-I). La vacunología inversa se utiliza en sanidad humana para identificar los epítopos de células T; sin embargo, en cerdos este concepto se ha sido introducido recientemente y por lo tanto se dispone de pocas herramientas. El objetivo principal de este trabajo era identificar epítopos de células T para diseñar racionalmente vacunas contra VGP. Para este propósito, se abordaron las siguientes estrategias. La vigilancia de VGP es fundamental para un control adecuado. La situación epidemiológica de VGP en España debía ser actualizada y se necesitaban más datos genéticos para permitir el uso de la vacunología inversa. El estudio realizado mostró que la situación epidemiológica de España era similar a la de otros países europeos; las cepas circulantes estaban estrechamente relacionadas y evolucionaron de la misma manera. Sin embargo, también se encontraron exepciones; una cepa evolucionó de forma divergente en España. Se sugiere que el cambio genético pueda ser un evento reciente en la evolución de esas cepas. Los ensayos in vitro para determinar la afinidad de unión de epítopos a CMHpo-I disponibles actualmente son pocos y están basados en moléculas recombinantes. Por lo tanto, en primera instancia se intentó generar una herramienta in vitro basada en la forma nativa del CMHpo-I. Para ello se diseñó y desarrolló casi por completo un ensayo de reconstitución de MHC aplicado a CMHpo-I, para el cual se generaron células C1R que expresaran el alelo SLA-1*es11 de los cerdos singénicos Babraham. Por último se puso a punto el ensayo de desnaturalización. A continuación, se aplicó la vacunología inversa para identificar epítopos de células T. Se predijeron epítopos del VGP in silico mediante NetMHCpan para los alelos CMHpo-I de los cerdos singénicos Babraham (SLA-1*es11 y SLA-2*es22); estos epítopos se probaron mediante ensayos funcionales ex vivo (IFN? y respuesta de proliferación) usando células de cerdos Babraham inmunizados. Desafortunadamente, este enfoque no dio ningun epítopo positivo. Los epitopos de células T fueron también identificados empíricamente. Las proteínas M1 y NP de un VGA humano fueron seleccionadas como diana, se estudiaron mediante el uso de péptidos solapantes y métodos funcionales (IFN? y respuestas de proliferación) hasta encontrar epítopos de células T. Los epítopos fueron analizados con células procedentes de cerdos Babraham inmunizados con VGA. Se encontraron dos epítopos CMHpo de clase II solapados, NP405-416 y NP407-420. En otro intento, se utilizó una estrategia más compleja de vacunología inversa. Esta había sido utilizada anteriormente por otros autores y comprende una combinación de métodos: predicción de epitopos in silico mediante NetMHCpan y validación de los resultados utilizando las preferencias de unión del alelo CMHpo determinadas in vitro, analisis in vitro mediante un ensayo de unión y analisis in vivo mediante tetrámeros. Los péptidos fueron identificados en animales infectados y expuestos a dos VGP heterólogos. Esta estrategia demostró ser muy precisa y así se identificó un epítopo inmunodominante (NA171-180). En general, estos datos allanan el camino para el diseño racional de una vacuna contra la SwIV a parte de proporcionar una nueva visión de la respuesta de los cerdos a la infección o inmunización con VGA.
