Ayuda
Ir al contenido

Dialnet


Molecular and functional approaches to understand the natural history of snake short disintegrins

  • Autores: Raquel Sanz Soler
  • Directores de la Tesis: Juan J. Calvete (dir. tes.), Libia Sanz (codir. tes.)
  • Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2016
  • Idioma: inglés
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Francesc Xavier Gomis-Rüth (presid.), Amparo Latorre (secret.), Nicholas Casewell (voc.)
  • Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Bioquímica y Biomedicina
  • Materias:
  • Enlaces
  • Resumen
    • Introducción: El grupo Reptilia, consta de aves y reptiles no aviares. Los reptiles son uno de los grupos de organismos vivos más notables, desde el punto de vista ecológico y evolutivo, que han colonizado la mayor parte del planeta. La mayor diversidad de los reptiles no aviares (96,4%) se concentra en Squamata (lagartos y serpientes). Por otra parte, tortugas y cocodrilos representan el 3,4% y el 0,2%, respectivamente (reptile-database.org) (Uetz and Hošek 2015). En la figura 1 (p.7) se muestra una cladogénesis generada a partir de datos mostrados en (Hedges and Vidal 2009; Pereiraa and Bakera 2009; Shaffer 2009; Shedlock and Edwards 2009; Vidal and Hedges 2009; Vidal et al. 2009), sin embargo, todavía existe controversia en cuanto a cómo y cuando aparecieron algunos taxones. Las serpientes pertenecen al suborden Serpentes, que representan 3567 especies distribuidas en todos los continentes excepto la Antartida (Uetz and Hošek 2015). Recientemente se han generado filogenias de serpientes, a partir de la integración de datos morfológicos y moleculares (Vidal et al. 2007; Castoe et al. 2009; Pyron et al. 2011; 2013; Reeder et al. 2015). A pesar de estos estudios, la posición relativa de algunas serpientes aún es objeto de debate. No obstante, Viperidae, Elapidae y Colubridae están contenidas en la superfamilia Colubroidea, que incluye a todas las serpientes venenosas conocidas, y a la mayoría de serpientes actuales (>2/3 sp.) (Vidal et al. 2009; Pyron et al. 2011; Pyron and Burbrink 2012) (Figura 4, p. 13). La gran diversidad de serpientes, junto con su plasticidad genética y fenotípica, convierte a las serpientes y sus venenos en objeto de estudio en muchas disciplinas, desde evolución, ecología y comportamiento, a medicina. Concretamente el estudio de los venenos de serpientes es de gran interés en varios aspectos. El conocimiento generado a partir del estudio del veneno, o de alguna de sus proteínas, podría aportar la base para el desarrollo de un nuevo medicamento, o ayudar a la generación de mejores antivenenos. Además, tales estudios podrían revelar nuevos mecanismos moleculares en mamíferos, mediante el uso de toxinas en estudios de receptores celulares como por ejemplo las integrinas. Los venenos de serpientes contienen una compleja variedad de componentes farmacológicamente activos, con y sin actividad enzimática. De todos ellos, en este trabajo nos hemos centrado en el estudio de una familia de proteínas que no poseen actividad enzimática, las disintegrinas. Esta familia ha servido como modelo para generar varios fármacos que están en el mercado para tratar el síndrome coronario agudo, mediante la inhibición de agregación plaquetaria (por ejemplo, Aggrastat® (Tirofiban) e Integrilin® (Eptifibatidae)) (Granada and Kleiman 2004). Únicamente los venenos de Viperinae y Crotalinae contienen disintegrinas, una familia de proteínas (41-100 aminoácidos) sintetizadas a partir de RNAs mensajeros cortos (Okuda et al. 2002) o liberadas en el veneno por procesamiento proteolítico de metalloproteasas de tipo PII (PII-SVMP) (Kini and Evans 1992; Fox and Serrano 2005). La familia de las disintegrinas incluye antagonistas potentes y específicos de los receptores de integrina ?1 y ?3, que han evolucionado en la parte apical de un lazo móvil de 11 residuos. La mayoría de las disintegrinas de cadena simple (largas, medias y cortas) expresan la secuencia RGD que representa el motivo de inhibición básico de la unión de las integrinas a sus ligandos y bloquea su función adhesiva. La evolución de las disintegrinas RGD, desde las disintegrinas largas, a las más recientes en la evolución, las disintegrinas cortas, implica una reducción de tamaño debida a la pérdida de cisteínas y procesamiento del extremo N-terminal. En todas ellas su actividad inhibidora depende de la apropiada formación de puentes disulfuro entre sus cisteínas, que determina la conformación del lazo móvil que alberga el motivo activo. Además de las disintegrinas canónicas (RGD/XXD), existen otro tipo de disintegrinas, que contienen los motivos KTS/RTS y se encuentran en venenos de víboras Euroasiáticas. Estas disintegrinas bloquean selectivamente la unión de la integrina ?1?1 a su ligando (colágeno I y IV) in vitro y bloquean la angiogénesis in vivo (Marcinkiewicz et al. 2003; Olfa et al. 2005; Brown et al. 2008). Estudios estructurales mediante RMN de las disintegrinas (K/R)TS (obtustatina y jerdostatina) han revelado que el bucle de unión a la integrina y el extremo C-terminal forman un epítopo funcional que muestra movimientos concertados (Moreno-Murciano et al. 2003b; Carbajo et al. 2011). La base estructural de la selectividad y especificidad de disintegrinas (K/R)TS por la integrina ?1?1, subyace en la forma y tamaño del lazo de unión a integrina de 9 residuos, junto con su composición, flexibilidad y orientación lateral del tripéptido (K/R)TS (Monleón et al. 2003; Calvete et al. 2005; Sanz et al. 2005; Calvete et al. 2007b; Carbajo et al. 2011). Las disintegrinas (K/R)TS son sintetizadas a partir de ARNs mensajeros cortos que codifican para un péptido señal, propeptido corto y el dominio disintegrina. La disintegrina RTS jerdostatina codificada por el gen RPTLN conserva esta estructura génica. Aunque la secuencia nucleotídica que codifica la disintegrina jerdostatina se conserva con identidad del 100% en la glándula del veneno de varias víboras euroasiáticas, Prothoboptrops jerdonii, Cerastes vipera y Echis ocellatus (Sanz et al. 2005; 2006; Bazaa et al. 2007), esta disintegrina RTS no se había encontrado en ningún veneno estudiado hasta la fecha. Varios estudios han discutido la difícil cuestión de explicar cuál podría ser el papel de las disintegrinas RTS con actividad antiangiogénica en el contexto predador-presa (revisado por Walsh and Marcinkiewicz 2011; Calvete 2013b). Recientemente, en el trabajo de Saviola et al. 2013, se sugirió una nueva función para las disintegrinas en el veneno. Puesto que la fracción del veneno que incluye las disintegrinas parece contener el elemento quimiotáctico que utiliza Crotalus atrox, para la relocalización de su presa envenenada y liberada de sus fauces. ? Objetivos: En esta tesis hemos explorado la relación evolutiva de dos clases de disintegrinas cortas, RGD y RTS/KTS, además de estudiar la distribución del gen RPTLN y su posible función en reptiles. Para ello se abordaron los siguientes objetivos parciales: 1. Establecer la historia natural de la familia RTS/KTS-disintegrinas, analizando la relación estructura-función de las disintegrinas RGD y RTS/KTS mediante la generación de mutantes quimera. 2. Definir los amino ácidos del lazo activo claves para la función de la disintegrina corta RGD ocellatusina. 3. Caracterizar el gen RPTLN completo, que codifica para una disintegrina RTS. Y explorar su distribución en reptiles. 4. Determinar la presencia o ausencia de transcritos del gen RPTLN y la posible traducción del dominio disintegrina en otros órganos distintos de la glándula del veneno. 5. Explorar la posible función de las disintegrina crotatroxina, del veneno de Crotalus atrox, como elemento relocalizador de la presa, así como la posibilidad de que la disintegrina ocellatusina tenga una función similar. Metodología Amplificación del gen RPTLN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR): La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR (polymerase chain reaction), es una técnica desarrollada en 1983 por Kary Mullis (Bartlett and Stirling 2003) que revolucionó los estudios de biología molecular. Para la identificación del gen RPTLN en distintos genomas se llevó a cabo la extracción de ADN genómico a partir de las muestras de sangre y tejido disponibles (Tabla 1, p.41) (Longmire et al. 1997). Posteriormente, se amplificó por PCR el fragmento completo del gen RPTLN a partir del ADN genómico de diversos reptiles. Los fragmentos de ADN candidatos se cortaron del gel de agarosa y se purificaron, con el fin de clonarlos y secuenciarlos. De este modo se identificaron los genes RPTLN-like contenidos en genomas de una amplia variedad de reptiles. Identificación de transcritos del gen RPTLN: La identificación de transcritos en determinados órganos de culebra (Rhinechis scalaris) y lagarto (Podarcis muralis y P. hispanicus) se llevó a cabo del mismo modo que la determinación del gen RPTLN en el ADN genómico de distintos reptiles. Sin embargo, en este caso se usó el ADN complementario (cDNA) como molde en la amplificación por PCR. Para la síntesis de cDNA se llevó a cabo la extracción de ARN de los órganos y a continuación se realizó retrotranscripción del ARN a ADN complementario (cDNA). Además, para poder observar diferencias de expresión de gen RPTLN entre los distintos órganos, se realizó la amplificación por PCR semicuantitativa y PCR cuantitativa. Análisis de secuencias y deposito en la base de datos NCBI: Las secuencias RPTLN-like obtenidas se identificaron utilizando BLASTn, y se depositaron en la base de datos NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Su alineamiento múltiple se realizó utilizando el programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetic analysis) (Kumar et al. 2001); y para la predicción de estructura secundaria de RNA se uso RNAfold WebServer (Mathews et al. 2004; Gruber et al. 2008; Lorenz et al. 2011). Extracción de proteína y detección de jerdostatin mediante Western Blot: El Western Blot es una técnica analítica ampliamente extendida que se usa para la detección de proteínas específicas en una muestra determinada. Concretamente en este trabajo se pretendía determinar la traducción de los transcritos del gen RPTLN detectados en órganos de Podarcis sp. y Rhinechis scalaris. Para ello se extrajo proteína total de los órganos mediante la homogenización de cada tejido en un tampón de lisis, incluyendo los inhibidores de proteasas necesarios. La detección de jerdostatina en nuestras muestras se realizó mediante Western Blot utilizando el anticuerpo primario anti-PEP160 que reconoce el péptido [CKPSYPGNG] en el extremo C-terminal de la jerdostatina. Expresión y purificación de disintegrinas recombinantes: Existe una amplia variedad de métodos de generación, expresión y purificación de proteínas. En nuestro caso, diseñamos y generamos plásmidos de expresión en bacterias, para la posterior expresión y purificación de disintegrinas recombinantes de forma soluble y activa. En el caso de crotatroxin, se determinó la secuencia nucleotídica de novo. Una vez conocida la secuencia de nuestras disintegrinas silvestres, se clonaron en un plásmido de expresión específico de bacterias (pET32a(+)), incluyendo la secuencia de reconocimiento de la proteasa TEV con el fin de poder cortar posteriormente la etiqueta de las disintegrinas recombinantes (Figura 23, p.50). La obtención de los plásmidos de expresión de las disintegrinas mutantes, que incluyen cambios puntuales en su secuencia de ADN, se realizó mediante mutagénesis dirigida. Los plásmidos de expresión generados se transformaron en la cepa de expresión BL21 de Escherichia coli, para la sobreexpresión de cada una de las disintegrinas recombinantes (Figura 25, p.54). Posteriormente, las disintegrinas recombinantes se purificaron a partir de la fracción soluble del lisado celular mediante varios pasos de purificación por afinidad, digestión por la proteasa TEV, y un último paso de purificación por cromatografía de fase reversa. La pureza de la muestra se testó mediante electroforesis en gel, 10%Tris-tricine SDS-PAGE, y espectrometría de masas (ESI-MS) (Figura 26, p.55). Purificación de disintegrinas a partir del veneno: Para aislar disintegrinas a partir del veneno, las proteínas solubles del veneno se separaron mediante cromatografía de fase reversa. Pureza e identificación de las disintegrinas mediante espectrometría de masas: Con el fin de identificar las disintegrinas purificadas a partir de material recombinante o del veneno se midieron las masas de las disintegrinas por espectrometría de masas mediante una fuente de ionización por nanoelectronebulización (Figura 27, p.57). Esto nos permitió confirmar la identidad de todas las disintegrinas, pureza y su correcta purificación. En cada caso, la masa monoisotópica teórica, se comparó con la masa calculada, considerando condiciones nativas, con la formación de 4 puentes disulfuro en el caso de las disintegrinas cortas y 6 en las de tamaño medio. Purificación de la integrina ?1?1 humana e inhibición de la unión de la integrina ?1?1 al fragmento CB3 del colágeno IV mediada por las disintegrinas: Las disintegrinas KTS/RTS inhiben la unión de la integrina ?1?1 a su ligando natural, colágeno IV/I. Por lo que para testar la capacidad de inhibición de unión de la integrina ?1?1 de nuestros mutantes quimera (RTS-ocellatusin) denominados Frankenstein, se purificó la integrina ?1?1 y se midió la inhibición de unión a su ligando mediante un ensayo ELISA. El ectodominio de la integrina ?1?1 humana se expresó en células Schneider de Drosophila sp., y se purificó siguiendo el protocolo descrito previamente por (Eble et al. 2006), posteriormente se testó su funcionalidad mediante una curva de titulación. La capacidad de inhibición de las disintegrinas se midió mediante un ensayo ELISA en el que el fragmento CB3 del colágeno IV fue inmovilizado en una placa de 96 pocillos y se incubó con una mezcla de la integrina ?1?1 a concentración fija y concentraciones crecientes de la disintegrina objeto de estudio. Posteriormente, se cuantificó la unión de la integrina ?1?1 por colorimetría y se transformó en porcentaje de no-inhibición. Las disintegrinas lebestatina y ocellatusina se usaron como control positivo y negativo de inhibición de unión de la integrina ?1?1, respectivamente. Preparación de las plaquetas en suspensión y estudio de la inhibición de la agregación plaquetaria (inducida por colágeno I), mediada por disintegrinas: Las disintegrinas que contienen el motivo de unión RGD (Arg-Gly-ASp) son capaces de inhibir la agregación plaquetaria mediante la unión a la integrina ?IIb?3 y con ello bloquean la unión del fibrinógeno a dicha integrina (Calvete et al. 1994). Este método se ha utilizado históricamente para la testar la capacidad de inhibición plaquetaria de diferentes péptidos. Para ello se aislaron las plaquetas humanas a partir de muestras de sangre fresca de voluntarios sanos, que no hubieran recibido ningún tratamiento médico que pudiese afectar a la respuesta de las plaquetas. Para la preparación de plaquetas lavadas en suspensión se siguió el protocolo previamente descrito en (Antunes et al. 2010). Para monitorizar la inhibición de la agregación plaquetaria por las disintegrinas, se midió la transmisión de luz y se transformó en porcentaje de agregación plaquetaria (Figura 28, p.60). El valor de agregación máxima (MA) se utilizó para comparar diferentes potencias inhibidoras. A partir de este valor, se calculó la concentración necesaria para reducir al 50% de la agregación plaquetaria inducida por Col I, con respecto al control (valor IC50). Experimentos de comportamiento de la serpiente de cascabel, Crotalus atrox, frente a las disintegrinas recombinantes crotatroxina y ocellatusina: Con el fin de determinar si la disintegrina crotatroxina es el elemento relocalizador de la presa y si ocellatusina pudiera tener la misma función, se realizaron análisis de comportamiento de las serpientes de cascabel, Crotalus atrox, permitiendo que inyectaran su veneno a un ratón sacrificado previamente. De este modo, se indujo la búsqueda quimiosensora de la presa (Chiszar et al 1992) y se retiró el ratón de la caja donde posteriormente se realizó el ensayo. Se metió en la caja un útil (Figura 29, p.62), que consistía en una base en la que se situaron dos bolsas (de rejilla), separadas entre ellas 4 cm; en una se introdujo un ratón inyectado con la disintegrina recombinante (ratón “envenenado”, E); en otra, el ratón control (ratón “no envenenado”, NE) (Figura 29, p.62). Se grabaron los ensayos y los videos fueron analizados por un observador que desconocía las condiciones del ensayo. En cada uno de los videos, se contaron el número de “flicks” (proyección/retracción) de la lengua de la serpiente, dirigidos a menos de 1cm del ratón E o NE. Por último, se llevó a cabo el análisis estadístico del número de “proyección/retracción” de la lengua de Crotalus atrox dirigidos hacia el ratón E o NE. Este número se convirtió en porcentaje con el fin de evitar la variabilidad natural de este dato. Estos datos fueron analizados empleando test t de Student para muestras emparejadas. Resultados y discusión: Capitulo I. 1. Ni la inserción del motivo RTS en diferentes posiciones del lazo funcional de ocellatusina, ni la sustitución del lazo RGD de ocellatusina completo [20CKMARGDNMHDYC32] por el lazo de la disintegrina RTS-jerdostatina [20CWRTS--VSSHYC32], son suficientes para conferir la funcionalidad de una disintegrina (R/K)TS, bloqueando la unión de la integrina ?1?1 al fragmento CB3 del colágeno IV. 2. El acortamiento del extremo carboxilo terminal, o la sustitución de la región C-terminal de ocellatusina [39CPRNPYKG46] por la de jerdostatina [39CPSYPGNG46], en mutantes que contienen el lazo funcional de jerdostatina [20CWRTS--VSSHYC32], no fueron suficiente para generar un sitio de inhibición de la unión de integrina ?1?1 a CB3 (Colágeno IV). Tampoco lo fueron los mismos mutantes en los que se incluyeron cambios en la región alrededor del lazo funcional [19ICWRTSVSSHYCT33] y [19TCWRTSVSSHYCN33]. 3. Al igual que en otras disintegrinas cortas RGD estudiadas previamente, los aminoácidos G25 y D26 del tripéptido activo RGD de ocellatusina, son clave para su actividad bloqueante de la unión de la integrina ?IIb?3 a fibrinógeno. 4. La sustitución de aminoácidos en el lado N-terminal del lazo activo de ocellatusina, concretamente, M22R y A23T, no son críticos per se para el mantenimiento de la función inhibidora de esta disintegrina. 5. La supresión de los aminoácidos E47-P50 de ocellatusina, no afectan a su función y potencia de inhibición de la agregación plaquetaria inducida por colágeno I. 6. A pesar de representar motivos funcionales y que podrían haber surgido evolutivamente con el cambio de un sólo nucleótido en el codón de la arginina (R), los tripéptidos SGD, TGD y GGD no se han encontrado en disintegrinas naturales Ello puede ser debido a que su potencia inhibidora es de dos ordenes de magnitud menor que la de las disintegrinas naturales (RGD, WGD, KGD, MVD). Estos resultados apoyarían la selección natural de las disintegrinas guiada por evolución positiva. Capitulo II. 1. Russellistatina es la única disintegrina RTS detectada hasta la fecha en un veneno de serpiente. 2. La secuencia completa del gen RPLTN está conservada en reptiles no aviares, con alto grado de identidad. Esta conservación en un taxón cuyo ancestro común existió hace mas de 250 millones de años parece indicar que el producto de este gen debe de estar realizando una función básica y específica de reptiles. Bien i) transcribiéndose a proteína, ii) actuando como ARN regulatorio o iii) cumpliendo otra función todavía desconocida. 3. El número de copias génicas diferentes del gen RPTLN encontradas en reptiles, y la presencia de varias de ellas en una sola especie, apoyan la idea de duplicación génica en el gen RPTLN. 4. El gen RPTLN se transcribe en distintos órganos de especies de las familias Lacertidae y Colubridae, pero no se ha detectado su traducción en los mismos, lo cual señala hacía una función como ARN no codificante. 5. Cuando se comparan los péptidos señal de SVMPs con los de las proteínas ADAM y disintegrinas RTS, se observa una conservación clara del péptido señal de las SVMP existentes, y del codificado por el gen RPTLN en las disintegrinas RTS. Por el contrario, las proteínas ADAM contienen péptidos señales distintos. Capitulo III. 1. Crotalus atrox reconoce significativamente el ratón inyectado con la disintegrina recombinante crotatroxina con respecto al ratón control. 2. Crotalus atrox no es capaz de diferenciar entre el ratón inyectado con la disintegrina recombinante ocellatusina y el ratón control. Conclusiones: 1. La conservación del gen RPTLN en reptiles, junto con los estudios estructura-función de los mutantes Frankenstein, aportan evidencias de que el gen ancestral de las disintegrinas cortas RTS/KTS fue reclutado potencialmente en las glándulas del veneno de la familia Viperidae, independientemente de la vía clásica de neofuncionalización de las disintegrinas que contienen el dominio RGD. 2. Postulamos que el gen RPTLN constituye una familia multigénica y su expresión y neofuncionalización está restringida a la glándula del veneno de las especies Macrovipera y Daboia, lo cual representa un evento reciente en la evolución. 3. La presencia de mARN del gen RPTLN en diferentes órganos de Podarcis sp. y Rhinechis scalaris, y la ausencia (o baja expresión) de distintegrina RTS en los mismos órganos, además de la conservación del gen RPTLN, sugiere una posible función del gen RPTLN como ARN no codificante (ncARN) en órganos de reptiles (no en tejidos de producción de veneno). 4. La conservación de la secuencia del péptido señal en las SVMPs existentes, también conservado el gen RPTLN, sugiere que esta región pudo haber jugado un papel en el reclutamiento de las SVMP y en su expresión restringida en la glándula del veneno de serpientes Caenophidian. 5. La funcionalidad de ocellatusina depende de los aminoácidos G25 y D26, y su potencia inhibidora del residuo R24. Ni los aminoácidos situados en el lado N-terminal del motivo RGD, en el lazo activo, ni los residuos E47-P50, en la cola C-terminal, son críticos per se para la funcionalidad de ocellatusina. 6. Nuestro datos han arrojado luz en cuanto a una nueva posible función de las disintegrinas, en Viperidae, como elemento quimiotáctico para relocalizar la presa. 7. El papel de las disintegrinas como elemento relocalizador de la presa parece ser específico de especie, indicando que esta función también podría contribuir a la evolución de las disintegrinas.


Fundación Dialnet

Dialnet Plus

  • Más información sobre Dialnet Plus

Opciones de compartir

Opciones de entorno