Estudi de la patologia molecular de les distrofinopaties: espectre mutacional i mecanismes modificadors del fenotip
- Autores: Jonás Juan Mateu
- Directores de la Tesis: María Pía Gallano Petit (dir. tes.), Virginia Nunes Martínez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jaume Campistol Plana (presid.), Aurora Sánchez Díaz (secret.), José María Millán Salvador (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
INTRODUCCIÓ: Les distrofinopaties són la malaltia neuromuscular més freqüent. Estan causades per mutacions al gen lligat al cromosoma X DMD. Aquest gen codifica per la proteïna distrofina, un element clau en l¿estabilització del sarcolema durant la contracció muscular. Els fenotips clínics inclouen la forma severa de distrofia muscular de Duchenne (DMD), la forma més lleu de Becker (BMD), una forma intermedia (IMD) i una cardiomiopatia dilatada sense debilitat muscular (XLCM). Entre un 8-22% de les femelles portadores presenta alteracions clíniques de diversa severitat. La DMD es caracteritza per una debilitat muscular d¿inici primerenc, ràpidament progressiva que provoca la pèrdua de deambulació abans dels 13 anys i la mort durant la 3a dècada. La BMD és clínicament heterogènia però presenta un inici més tardà i una progressió més lenta. La severitat clínica depèn principalment del manteniment de la pauta de lectura del gen, permetent l¿expressió de distrofina semifuncional amb els dominis N-term i C-term d¿unió proteïna-proteïna preservats. Les mutaciones nonsense/frameshift produeixen l¿absència de distrofina al múscul esquelètic i un fenotip DMD. Les mutacions in-frame permeten l¿expressió anòmala i/o reduïda de distrofina i un fenotip més lleu BMD. Un 10% dels pacients presenta excepcions a aquesta regla i la producció de transcrits alternatius es considera un modificador clau de la severitat clínica. La teràpia en estudi de exon-skipping mediada per AONs és basa en el bloqueig de senyals d¿splicing per tal d¿induir el salt d¿exó i la restauració de la pauta de lectura. Fins anys recents l¿estudi mutacional es limitava, degut a la gran mida del gen (2.4Mb, 79 exons i 8 promotors), a l¿anàlisi de grans reordenaments intragènics que suposen el 65-70% de les mutacions causals. Recentment, el desenvolupament d¿estratègies d¿alt rendiment ha permès incrementar el número de mutacions puntuals identificades, encara que en la majoria de casos l¿impacte d¿aquestes sobre l¿mRNA es desconeix.
OBJECTIUS I METODOLOGIA: Els principals objectius d¿aquesta tesi van ser analitzar l'espectre mutacional del gen DMD, i caracteritzar els mecanismes modificadors del fenotip en aquells pacients que presenten excepcions a la llei de la pauta de lectura i en portadores simptomàtiques. Amb aquesta finalitat es va: 1) establir un algoritme diagnòstic basat en MLPA i seqüènciació de mRNA de biòpsia muscular; 2) determinar els patrons de splicing per QF-RTPCR i analitzar les senyals de splicing implicades mitjançant matrius bioinformàtiques de predicció; 3) estudiar els patrons de inactivació del cromosoma X en portadores simptomàtiques.
RESULTATS: Es descriu la tercera sèrie més extensa de pacients afectats de distrofinopatia amb 576 casos no emparentats. Es van identificar 275 mutacions diferents, de les quals 85 no havien estat descrites anteriorment. Els resultats evidencien l¿alta heterogeneïtat al¿lèlica del gen DMD i confirmen que l¿algoritme diagnòstic utilitzat permet detectar tot tipus de mutacions, incloent alteracions intròniques de splicing i reordenaments complexos de difícil genotipatge. La llei de la pauta de lectura és capaç de predir el fenotip clínic en el 88% dels pacients. No obstant, les excepcions són relativament freqüents en el fenotip BMD, i en les duplicacions exòniques i mutacions puntuals. Fins a un 28% de les mutacions puntuals altera el patró normal de splicing, observant-se una amplia variabilitat transcripcional que condiciona el fenotip clínic. S¿observa que el patró de splicing aberrant és altament depenent de la interacció entre la força relativa del 3¿ ss i la densitat d¿elements reguladors ESE. L¿existència d¿altres factors com el context genòmic poden jugar un rol rellevant en alguns exons, suggerint un model més complex. Es descriu que el fenotip cardíac pur XLCM pot ser originat per mutacions al gen DMD en mosaïcisme somàtic. S¿aporten dades que indiquen que la normalització genètica és un mecanisme plausible en la prevenció o mitigació dels símptomes al múscul esquelètic en pacients amb mutacions somàtiques. En les femelles portadores de distrofinopatia s¿observa que el grau de biaix de la inactivació del cromosoma X està relacionat amb la severitat clínica, i que els patrons d¿inactivació esbiaixats són heretats familiarment en la majoria dels casos. No obstant, l¿avaluació del patró de XCI mitjançant l¿assaig de metilació del gen AR té un baix valor pronòstic. Es descriu una nova presentació clínica de distrofinopatia amb retard mental sense debilitat muscular en dones portadores. S¿amplia d¿aquesta manera l¿espectre fenotípic associat a mutacions al gen DMD, afegint noves dades a la història natural de la malaltia.
CONCLUSIONS: Els resultats obtinguts contribueixen a ampliar el coneixement de la patologia molecular de les distrofinopaties i aporten noves dades sobre el procés de producció de transcrits alternatius implicats en la modulació fenotípica que podrien ser rellevants per al disseny de molecules antisentit per a la teràpia de exon-skipping.
