Mecanismos epigenéticos implicados en la inmortalización de linfocitos b infectados con el virus epstein-barr
- Autores: Henar Hernando Arrabal
- Directores de la Tesis: Esteban Ballestar (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carme Caelles Franch (presid.), Alejandro Vaquero García (secret.), Juan Ausio (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
En la presente tesis doctoral se ha abordado el estudio de los cambios en la metilación del DNA y en las modificaciones de histonas que tienen lugar en las células B cuando son infectadas con el EBV.
Introducción: El EBV es un gammaherpesvirus que infecta a más del 90% de la población adulta. La infección primaria suele ser asintomática o puede causar la mononucleosis infecciosa. Tras esta primera toma de contacto con el virus, el EBV permanece de forma latente de por vida en las células B del huésped. En condiciones normales esta infección se mantiene controlada por el sistema inmune, pero bajo determinadas circunstancias el virus puede reactivarse y dar lugar al desarrollo de determinados tipos de cáncer y enfermedades autoinmunes. A parte de infección que produce in vivo, el EBV es capaz incluso de infectar células B in vitro y transformarlas en líneas celulares linfoblastoides (LCLs) que proliferan indefinidamente. Por ello la inmortalización de linfocitos B con el EBV supone un excelente modelo de estudio para determinar los mecanismos que hacen que una célula B en reposo se transforme en un linfoblasto con capacidad de proliferación.
Resultados: Tras la realización de un análisis a gran escala del estado de metilación de la célula B antes y después de ser inmortalizada con el EBV se obtuvieron un total de 256 promotores génicos que se desmetilan durante el proceso, sin embargo no se encontró hipermetilación. Del estudio de la dinámica de esta desmetilación se observó que ésta tiene lugar una vez la célula comienza a dividirse, por lo tanto estamos ante un proceso de desmetilación pasiva del DNA que se asocia a ineficiencia en el mantenimiento de la metilación por las DNMTs. Esta hipótesis se corrobora a la vista de los resultados del análisis de las secuencias adyacentes a las CpGs que se hipometilan, las cuales están enriquecidas en sitios de unión de factores de transcripción específicos de linfocitos B. A pesar de que la mayor parte de los genes que se desmetilan ya se expresan en la célula B antes de ser infectada, la desmetilación de DNA se asocia a la activación de genes esenciales para el proceso. La funcionalidad de esta desmetilación queda demostrada al observar que la inducción farmacológica de la desmetilación del DNA mejora la proliferación durante la inmortalización.
El segundo cambio epigenético más importante son las modificaciones postraduccionales de las histonas. Por ello se procedió al estudio de la dinámica de estas modificaciones a distintos tiempos durante el proceso de inmortalización. Se observó una pérdida y redistribución de tres marcas de heterocromatina: H3K9me3, H3K27me3 y H4K20me3 durante la conversión de RBLs a LCLs mediada por el EBV. Se procedió a la identificación de las secuencias genómicas en las que se produce la caída de H3K9me3, H3K27me3 y H4K20me3 en la conversión de RBLs a LCL, y se obsevó que la caída tiene lugar en las típicas regiones diana de cada una de estas marcas. En el caso de la H4K20me3 en secuencias repetitivas pericentroméricas y subteloméricas; en el caso de la H3K9me para genes de la familia ZNF; para la H3K27me3 en genes de la familia HOX. Puesto las marcas de heterocromatina están asociadas con compactación se procedió al análisis de la accesibilidad a endonucleasas en células B y LCLs. Como era de esperar por la caída de marcas de heterocromatina, se observó un aumento en la accesibilidad de la cromatina en LCLs. Pero cuando se intentó relacionar ambos procesos, las marcas de histonas con el incremento de la accesibilidad se puso de manifiesto que estos dos eventos ocurren de manera independiente, ya que los sitios genómicos en los que se produce una caída de marcas de heterocromatina no presentan diferencias en la accesibilidad a endonucleasas.
Para finalizar, en este trabajo se estudió la desregulación epigenética de una de las enzimas claves para la metilación del DNA, la DNA metiltransferasa 3B (DNMT3B). Se observó que es necesaria para mantener la hipermetilación y por tanto el silenciamiento de oncogenes y que su regulación epigenética es clave para que pueda llevar a cabo este proceso de manera correcta.
Conclusiones: de los resultados obtenidos en esta tesis doctoral se pude concluir que la inmortalización de linfocitos B con el EBV supone la desmetilación de unos 250 genes, en su mayoría ya activos en la célula B. Esta desmetilación tiene lugar de manera pasiva, por una baja eficiencia de la mantención de la metilación en estas regiones transcripcionalmente activas una vez que las células comienzan a dividirse. Esta desmetilación a su vez es funcional, puesto que supone la sobre-expresión de genes clave en el proceso, y además la inducción farmacológica de la desmetilación favorece la transformación. Junto a los cambios de metilación se está produciendo una caída de tres de las más importantes marcas de heterocromatina, lo cual supone un claro aumento en la accesibilidad de la cromatina en LCLs comparado con las células B. Pero a pesar de los indicios, estos dos eventos no están relacionados. Tampoco parecen estar relacionados los genes que se hipometilan con aquellos en los que caen las marcas H3K9me3 y H3K27me3. Cuando estudiamos la regulación de la DNMT3B, vemos que además de regular la expresión de otros genes por hipermetilcion del promotor, ella misma se regula por el estado de metilación de su secuencia promotora. Todos estos hechos ponen de manifiesto las complicadas interrelaciones que existen entre los diferentes mecanismos epigenéticos que regulan el programa de transcripción de la célula en procesos como la transformación.
