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Cuantificación de células endoteliales circulantes como factor predictivo de respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico de células no escamosas

  • Autores: Alfredo Sánchez Hernández
  • Directores de la Tesis: Óscar Juan Vidal (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir ( España ) en 2013
  • Idioma: español
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: TESEO
  • Resumen
    • El cáncer de pulmón supone el 12% de todos los cánceres diagnosticados en el mundo. Su alta incidencia junto a su baja tasa de supervivencia lo llevan a ser la principal causa de muerte por cáncer en los países occidentales. Existe un claro predominio del tipo histológico no microcítico, 80% de los casos en Europa y 85% en EE.UU. La mayor parte de los casos se diagnostican en estadios avanzados y pese a los avances terapéuticos, su supervivencia a los 5 años es del 2%.

      El estudio de factores pronósticos y predictivos con el estudio del perfil molecular del tejido tumoral está en investigación constante. Su objetivo es personalizar el tratamiento en función de este perfil particular y así optimizar la eficacia de los agentes disponibles.

      En los últimos años se están consiguiendo avances significativos tanto en las técnicas de imagen como en la identificación de marcadores serológicos con valores pronósticos y predictivos, lo cual ha hecho que se vayan incorporando progresivamente en el manejo de los pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). Es importante identificar herramientas diagnósticas que determinen de forma precoz la efectividad de la terapia utilizada para saber qué pacientes se benefician o no de la misma. Esto permitiría, no solo optimizar costes, sino modificar la estrategia terapéutica de los pacientes que no responden y evitar efectos secundarios innecesarios.

      Las células endoteliales circulantes (CEC) representan una población de células endoteliales maduras que se descaman desde la íntima de los vasos sanguíneos a la circulación. El número de éstas en individuos sanos es muy bajo y el incremento en su número indica la presencia de daño en el endotelio vascular. Este defecto de adhesión en estados patológicos puede ser resultado de la apoptosis, o de la acción de proteasas granulocíticas o citoquinas (por ej. TNF alfa). Se ha observado un aumento del número de CEC en distintos procesos como infecciones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes y cáncer. Sin embargo, estas CEC son heterogéneas y pueden ser apoptóticas, necróticas o viables. Se ha demostrado que las CEC son más numerosas y viables en pacientes con cáncer que en individuos sanos.

      Los dos métodos principales para la cuantificación de CEC están basados en la separación por inmunomagnetismo o mediante la citometría de flujo. En ambos, la detección de CEC depende en última instancia de la disponibilidad de marcadores específicos para identificar las células endoteliales Hasta la fecha se han reportado diferentes estudios en distintos tipos de cáncer y estadios de la enfermedad sobre el papel de las CECs como factor pronóstico y predictivo. Los resultados obtenidos muestran discrepancias significativas en cuanto a su papel predictor y pronóstico tanto de respuesta como de supervivencia.

      En este estudio, investigamos si la cuantificación de CEC basales y su evolución durante el tratamiento, tienen un papel pronóstico y/o predictivo en pacientes con CPNM no escamoso tratados con platino y pemetrexed Material y métodos:

      Estudio prospectivo, abierto, multicéntrico en el que participaron 9 centros españoles. Se incluyeron pacientes con diagnóstico citológico o histológico de CPNM no escamoso Estadio IV, que no hubieran recibido quimioterapia previa, con un Performance status 0 a 2, y que hubieran otorgado su consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por los comités éticos de las instituciones.

      Con el fin de que la muestra fuera homogénea, los pacientes fueron tratados con la combinación de una sal de platino y pemetrexed, entre 4 y 6 ciclos, según los siguientes esquemas: Cisplatino 75 mg/m2 + Pemetrexed 500 mg/m2 cada 21 días ó Carboplatino (AUC=5-6) + Pemetrexed 500 mg/m2 cada 21 días. El tratamiento de mantenimiento con Erlotinib o Pemetrexed 500 mg/m2 quedó a criterio del investigador. Se recogían muestras de sangre periférica en tres momentos de la evolución: de forma basal, antes del 2º y del 3º ciclo de tratamiento. Se incluyeron datos sobre edad, sexo, consumo de tabaco, comorbilidad, número y localización de las metástasis, estatus de EGFR, respuesta y supervivencia. Tras el tercer ciclo de quimioterapia se realizó la valoración clínica basada en TC según criterios RECIST (Response evaluation criteria for solid tumors).

      La separación y recuento de CEC se realizó en el Hospital Arnau de Vilanova de Valencia por inmunomagnetismo: CellSearch®- Circulating endothelial Cells Kit (CellTracksAnalyzer®) . La muestra de sangre de obtuvo de forma aséptica por punción venosa en un tubo conservante CellSave®, tras haber descartando la primera sangre tras la punción para evitar así interferencias por el traumatismo inicial de la pared váscular. Los tubos se llenaron hasta que el flujo sanguíneo se detuvo para asegurar la proporción correcta de la muestra al anticoagulante y conservante, asegurando siempre un volumen de al menos 4 mL para la realización del análisis. Inmediatamente se mezclaba suavemente invirtiendo el tubo ocho veces impidiendo la coagulación. Se transfirieron 4 ml de sangre del tubo conservante CellSave en el correspondiente tubo cónico de 15 ml. Seguidamente se añadieron 10 ml del tampón de dilución en este tubo cónico y se mezcló por inversión cinco veces. A continuación el tubo se centrifugó a 800 g durante 10 minutos. La muestra se procesó en el CellTracks Autoprep System® dentro de la hora siguiente a la de preparación de la muestra. Los reactivos fluorescentes utilizados son los siguientes: anti-CD105-PE / anti-CD45-APC (anti-CD105 es específico para la proteína endoglina que es expresada por las células endoteliales; monocitos activados, células del estroma y las células pre-B, y la expresión de anti-CD45 se limita a los leucocitos); y 2-(4-amidinofenil)-1H-indol-6-carboxamidina (DAPI), que es la sonda fluorescente que tiñe el núcleo de la célula. La mezcla de reactivos y muestra se dispensa por el equípo CellTracks Autoprep System® en un cartucho que es insertado en un dispositivo de presentación celular MagNest® y se dejó incubar en oscuridad durante un mínimo de 20 minutos. La fuerza del campo magnético del dispositivo MagNest® hace que las células marcadas magnéticamente de forma positiva para el CD146 (CD146 +) se muevan a la superficie del cartucho. El CellTracks Analyzer II® escanéa automáticamente toda la superficie del cartucho, adquiere imágenes y muestra al usuario en un formato de galería para la clasificación final de las células magnéticamente capturadas. Un evento se clasifica como un CEC cuando su características morfológicas son consistentes con la de una célula y exhibe los fenotipos de forma correcta, es decir: CD146 +, CD105 +, DAPI + y CD45 -.

      Se estimó el tamaño muestral para conseguir diferenciar la respuesta a la enfermedad a partir de un cambio del 45% en el recuento de las CEC con una potencia del 90% y una ¿=0.05 bilateral considerando valores de desviación estándar para las CEC de 832 tal como se reporta en el estudio de Kawaishi et al, de forma que la estimación de muestra necesaria fue de 52 pacientes.

      Dado que se pretendía realizar extracciones para el recuento de CEC en tres momentos diferentes del estudio en los pacientes incluidos, esta estimación fue aumentada en un 30 % (15,6 ¿ 16 pacientes), considerando que debían incluirse 68 pacientes.

      Al tratarse de un estudio descriptivo exploratorio, el análisis estadístico se centró en la descripción de las variables recogidas. Los estadísiticos se han adecuado a la naturaleza de cada variable. Las variables cuantitativas se expresaron como la media o la mediana más-menos la desviación estándar o bien su intervalo de confianza al 95%. Las variables cuantitativas con una distribución normal se compararon con el test de t-Student y si no siguieron una distribución normal se empleó el test no paramétrico de U Mann Whitney. Las variables cualitativas se compararon con el test de Pearson; se aplicó el test exacto de Fisher cuando alguna la frecuencia esperada no fue mayor de 5.

      Las determinaciones de las Células Endoteliales Circulantes (CEC) fueron numéricas (variables cuantitativas) y se transformaron como en variables cualitativas agrupando las medidas por cuartiles. Para normalizar el resultado del recuento de CEC, estos se transformaron de forma logarítmica asegurando así la normalidad y disminuyendo la dispersión de los datos.

      La supervivencia global se calculó desde la fecha de inclusión hasta la muerte o bien hasta el último contacto con el paciente (casos censurados). El intervalo libre de enfermedad se calculó desde la fecha de inclusión hasta la fecha de diagnóstico de recidiva tumoral, ya sea local o a distancia. Se estableció como límite de significación estadística un valor de p<0,05.

      Para comprobar la eficacia diagnóstica sobre las variables se utilizaron curvas de sensibilidad (S) frente a 1-especificidad (E), curvas ROC, calculando en cada caso el área bajo la curva (AUC). Las supervivencias medianas se calcularon según el método de Kaplan-Meier. Para la comparación de curvas de supervivencia se utilizó la prueba de los rangos logarítmicos de Cox-Mantel (Log-Rank). Se aplicó el modelo de riesgos proporcionales de Cox para analizar el efecto entre las covariables y la supervivencia; El criterio usado para la introducción de las covariables fue la prueba de la razón de verosimilitud por pasos hacia delante. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS (Statistical Package for Social Science) para Windows, versión 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) y el software libre R version 2.15.1 (2012-06-22: "Roasted Marshmallows").

      Resultados:

      Entre junio 2010 y julio 2011 se incluyeron 69 pacientes en el estudio. El estudio fue aprobado por los comités éticos de los centros participantes y los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. La edad mediana fue de 61 años (rango 40-82) De ellos, 48 eran varones (69.9%).

      Para los análisis comparativos del recuento de CEC, se excluyeron los datos de los pacientes a los que no se habían recogido todas las muestras contempladas. El total de pacientes con tres muestras fue de 51.

      En 67 pacientes se realizó la determinación basal. El rango de CECs fue de 8 a 965 cel/4.0mL de sangre con una media de 153 y una desviación estándar de 204. Tras iniciar el tratamiento con platino + pemetrexed, se obtuvieron las determinaciones de 58 pacientes previo al segundo ciclo y de 53 pacientes previo al tercero. Los niveles de CECs fueron en ascenso en estas determinaciones. Previo al segundo ciclo el rango era de 10 a 1388 cel/4 mL con una media de 195 y una SD de 263; previo al tercero, el rango fue de 5 a 1857 con una media de 248 y una SD de 356. No hubieron diferencias significativas en la cantidad de CECs cuando se realiza el análisis por subgrupos en función de las características de sexo, edad, hábito tabáquico, PS y número y localización de las metástasis.

      Veinticinco (36,23%) pacientes tuvieron respuesta parcial (RP) y 17 (24,64%) enfermedad estable (EE). 16 pacientes (23,19%) progresaron (PD). Se correlacionan las respuestas radiológicas obtenidas con la variación en los niveles de las CECs sin obtener diferencias entre los resultados de los pacientes que obtuvieron respuesta y/o estabilidad de su enfermedad frente a los que progresaron. El análisis por cuartiles tampoco evidenció diferencias significativas. Sin embargo, al estudiar su relación con la progresión y el exitus, se encontró que el aumento de más del 50% en el logaritmo del recuento de CECs tras el primer y segundo ciclo frente al nivel basal, se correlaciona de forma estadísticamente significativa con la progresión (p = 0.008 y p = 0,039), pero no con el exitus. No ocurre así cuando se realiza el análisis entre el segundo y tercer ciclo.

      La mediana de SLP fue de 5 meses (IC95% 5,47-9,22). Se realiza un análisis univariado con la media de la cuantificación de todos los pacientes incluídos y se analiza la supervivencia en función de que este nivel se encuentre por encima o por debajo de la misma. La mediana de SLP de los pacientes con niveles superiores a la media fue de 8 meses frente a 5 en los pacientes con niveles inferiores (p = 0,295). La mediana de SG para los pacientes que presentaban niveles de CECs por encima de la media (153) fue de 11 meses frente a 8 meses para los pacientes con niveles por debajo. Pese a esta tendencia, no existe una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,209). La transformación logarítmica de los resultados tampoco ofrece unas diferencias estadísticamente significativas. El análisis de regresión de COX para las localizaciones metastásicas concretas que se acompañaban de peor pronóstico (cerebrales, hepáticas y suprarenales) no halló resultados significativos.

      Conclusiones:

      En este grupo homogéneo de pacientes con CPNM tratados con un esquema de platino y pemetrexed en primera línea, la cuantificación de CEC en situación basal y antes del segundo y tercer ciclo de quimioterapia no ha demostrado ser un factor predictivo de respuesta. Por otro lado, los niveles basales superiores a la media podrían ser un factor pronóstico de mayor supervivencia global. Un aumento superior al 50% en el logaritmo del recuento de CEC tras el primer y segundo ciclo de quimioterapia en comparación con el valor basal se correlaciona con la progresión de enfermedad. Por último los niveles de CEC no se correlacionan con los factores pronóstico clínico-patológicos de supervivencia.

      La alta prevalencia y baja supervivencia del CPNM hacen que la investigación en esta patología sea prioritaria. El conocimiento precoz de la evolución de los pacientes con los tratamientos actualmente disponibles podría traducirse en una menor toxicidad y en una mejoría de la supervivencia


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