Resumen de Estudio del efecto de factores inductores de resistencia a la insulina sobre la activación del ERK1/2 y PKB estimuladas por insulina. Efecto de las fosfatasas en la activación de ERK5
Lourdes Maite García Quintanilla
En la mayoría de estudios sobre la resistencia a la insulina se relaciona esta patología a cambios en la fosforilación del principal sustrato del receptor de la insulina, la proteína IRS-1, pero no se ha estudiado cuales son los efectos que provocan estos cambios en la cascada de señalización intracelular estimulada por la insulina. En este trabajo se estudia cómo factores que inducen resistencia a la insulina afectan las dos vías principales estimuladas por la hormona, la vía de la MAP quinasa y la vía PI3K, y su relación con los cambios en la fosforilación de IRS-1.
Entre las citoquinas asociadas a la resistencia a la insulina en tejido adiposo destaca el TNF¿. En este trabajo estudiamos el efecto producido por la preincubación de estas células con TNF¿ en las vías anteriormente mencionadas estimuladas por insulina. Curiosamente, aunque en estas células la presencia de TNF¿ induce la fosforilación de la Ser307 de IRS-1 y una disminución en las fosfotirosinas de la molécula en respuesta a la insulina, esto no se reflejó en cambios en la activación de ERK1/2 y PKB. Por tanto, esto indica que a los tiempos analizados no existe correlación entre los cambios en la fosforilación de IRS-1 y el efecto en las vías de señalización.
También estudiamos los efectos del estrés oxidativo (H2O2) y la preincubación con la propia hormona sobre las dos vías mencionadas anteriormente. En el caso del agua oxigenada se observa que el tratamiento de las células con este compuesto resulta en un bloqueo de la activación de la PKB y de la MAP quinasa. Mediante el uso de inhibidores de diferentes quinasa demostramos que este bloqueo no se debe a las quinasas estimuladas por estrés. En el caso de la PKB el bloqueo se debe a la activación de la MAP quinasa ya que el efecto se revierte con inhibidores específicos de esta vía. En el caso de la MAP quinasa ninguno de los inhibidores utilizados es capaz de revertir el bloqueo, por tanto no se puede atribuir a las quinasas de estrés ni a la propia MAP quinasa. En el caso de esta última vía, los ensayos en los que se determina la activación de ras indican que el bloqueo se produce por encima de este componente de la vía. Tampoco se observa una correlación entre estos efectos y la fosforilación de IRS-1, pues el H2O2 aunque aumenta la fosforilación de la Ser307 también aumenta la fosforilación en tirosinas de IRS-1.
Finalmente, en el estudio del efecto de la insulina se observa que la estimulación de estas células con la hormona produce una activación prolongada de la PKB mientras que en el caso de la MAP quinasa se produce una activación transitoria que disminuye a los pocos minutos hasta valores próximos al basal. La posterior estimulación con insulina no resulta en una nueva activación de la vía MAP quinasa. Por tanto, se puede concluir que una vez que las células se han estimulado por la insulina la vía de la MAP quinasa se vuelve refractaria a una nueva estimulación. Este efecto está regulado por la propia MAP quinasa y no participa ninguna quinasa de estrés, como lo demuestra el estudio hecho con diferentes inhibidores de estas vías.
En la segunda parte de esta tesis se estudia el papel que tienen las Ser/Thr fosfatasas sobre la vía de activación de la quinasa ERK5. Esta quinasa pertenece a la familia de las MAP quinasas y se estimula tanto por factores de crecimiento como por diferentes tipos de estrés. Si bien en la mayoría de los casos el papel de las fosfatasas en la regulación de estas vías se ha asociado con la regulación negativa, en el caso de la ERK5 parece que también tendrían un papel importante en la activación de la vía. De esta forma, la incubación de células PC12 en presencia de inhibidores específicos de las Ser/Thr fosfatasas PP1 y PP2A resulta en un bloqueo de la activación de ERK5 en respuesta a dos factores de crecimiento diferentes (EGF y NGF) y al H2O2. Este efecto no es el resultado de una interacción inespecífica de los inhibidores ya que se observa utilizando dos inhibidores con estructuras diferentes. Además, el efecto es dependiente de la concentración y coincide con la potencia de estos compuestos como inhibidores de fosfatasas.
Dado que se había descrito que en células PC12 la activación de ERK5 era dependiente de ras, mientras que en el caso de la línea celular HeLa era independiente de ras, también se realizaron experimentos en este tipo celular observándose el mismo efecto. Esto indicaría que las fosfatasas actúan en un sitio común en ambas vías. No obstante, en una aproximación experimental para ver si en células PC12 el efecto quedaba por debajo de ras en la vía de señalización, obtuvimos resultados que discrepaban con los resultados publicados. Así, los datos utilizando una forma constitutivamente activa de ras en células PC12 indican que al contrario de lo publicado, en estas células la activación de ERK5 es independiente de ras.
Dado que se ha observado que PKC actúa como un regulador negativo de la vía ERK5 se pensó que la diana intracelular de estas fosfatasas podría ser el lugar fosforilado por PKC. Los resultados obtenidos mediante el uso de inhibidores de PKC y de las fosfatasas descartan esta posibilidad.
