Genomic and proteomic study of antimicrobial resistance in Escherichia coli and Enterococcus spp. recovered from wild animals

• Autores: Hajer Radhouani
• Directores de la Tesis: Patrícia Alexandra Curado Quintas Dinis Poeta (dir. tes.), Gilberto Paulo Peixoto Igrejas (dir. tes.), Carmen Torres Manrique (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro ( Portugal ) en 2015
• Idioma: portugués
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: repositorio.utad.pt
• Resumen
  • português

    As ferramentas genómicas, proteómicas e bioinformáticas permitem um conhecimento mais aprofundado sobre a fisiologia e estrutura bacterianas e também dos mecanismos envolvidos na resistência antimicrobiana. A resistência aos antimicrobianos tem evoluído e disseminado entre bactérias, representando uma séria e crescente ameaça para a saúde pública. No entanto, esta resistência tem sido detectada também na ausência de exposição antimicrobiana em animais selvagens, suscitando questões acerca dos mecanismos de ocorrência e persistência de estirpes resistentes sob condições similares, e as implicações para estratégias de controlo de resistência. Com o objectivo de estudar a resistência antimicrobiana em Escherichia coli e Enterococcus spp., foram recolhidas 151 amostras fecais de três espécies de animais selvagens nomeadamente gaivotas-de-patas-amarelas (Larus cachinnans, 57), águias-de-asa-redonda (Buteo buteo, 42) e raposas-vermelhas (Vulpes vulpes, 52). As amostras de gaivota foram recolhidas na reserva natural das Berlengas, as de águia no parque nacional da Peneda-Gerês e em outras áreas de conservação de Portugal e as amostras de raposa foram recolhidas no Norte de Portugal durante o período sazonal de caça. Através de placas de Levine e Slanetz-Bartley sem antibiótico foram isolados um total de 111 E. coli (73,5%) e 135 enterococos (89,4%). Após o isolamento em placas selectivas suplementadas com cefotaxima (CTX) e vancomicina, respectivamente, a ocorrência de E. coli produtoras de ß- lactamases de amplo espectro (BLAE) foi de 12,7% (gaivotas, 19,3%; águias, 15,2%; raposas, 4%) e a prevalência de enterococos resistentes à vancomicina (ERV) foi de 20,4% (gaivotas, 10,5%; águias, 36,4%; raposas, 21,1%). Todos os isolados de E. coli CTX-resistentes revelaram um fenótipo de resistência à cefotaxima e/ou à ceftazidima, apresentando um resultado positivo para a produção de BLAE. O genes da ß-lactamase mais predominante foram os genes blaTEM-52 e blaCTXM-32 (34,8%) juntamente com os genes blaCTX-M-1 (17,4%), blaSHV-12 (8,7%), blaOXA-1 e blaCTX-M-14a (4,3%). A maioria dos isolados de E. coli produtores e não produtores de BLAE foram multirresistentes, demonstrando níveis elevados de resistência à tetraciclina (57,5%), estreptomicina (53%) e sulfametoxazol/trimetoprim (35,1%), devido à presença dos genes tet(A) e/ou tet(B) (81,7%), o gene aadA (45,1%) e a diferentes combinações de genes sul (97,8%), respectivamente. O gene de virulência mais comum foi o fimA (63,3%) sendo que a maioria dos isolados de E. coli pertenciam aos grupos filogenéticos A (39,1%) e B1 (27,3%). Entre os isolados de enterococos resistentes e não resistentes à vancomicina, as espécies mais comuns foram E. faecium e E. faecalis. Foram detectados níveis elevados de resistência à tetraciclina e à eritromicina e os perfis genotípicos de resistência foram diversos nestes isolados, o genótipo mais comum foi tet(M)+tet(L)+erm(B). No que respeita a factores de virulência sendo os genes gelE, hyl, cpd, esp e agg foram os mais predominantes. Foram encontrados isolados de ERV com resistência adquirida à vancomicina (genótipo vanA) em 11,3% das amostras fecais analisadas; e 9,1% das amostras apresentaram ERV com resistência intrínseca à vancomicina (genótipo vanC1). Através da análise por MLST (Multilocus Sequence Typing) conclui-se que os isolados vanA-E. faecium pertencam ao ST273 e ST262 (complexo clonal CC17) e também ao ST5. As estirpes de E. coli produtoras de BLAE e de enterococos com vanA foram também estudadas através de uma abordagem proteómica detalhada abrangendo electroforese bi-dimensional (E2D) e identificação por espectrometria de massa com ionização a laser assistida por matriz com analisador tempo de voo (MALDI-TOF MS). Um total de 686 spots foram excisados a partir dos geis E2D de 4 estirpes de E. coli produtores de BLAE e 3 estirpes de ERV dos quais 562 proteínas foram identificadas com sucesso (81,9%) e caracterizadas por interrogação de base dados. As proteínas identificadas foram associadas a diferentes funções biológicas, tais como glicólise, transporte, biossíntese, resistência aos antibióticos, entre outros. Os resultados obtidos em E. coli e enterococos revelaram a presença de proteínas envolvidas na resposta ao stress, tais como as proteínas chaperone DnaK, WrbA, GroL, entre outras. Adicionalmente, a proteína VanA (MM: 37419,10938 / PI: 5,79), que evita a ligação da vancomicina/teicoplanina, foi identificada ao analisar o proteoma total de estirpes de enterococos vanA. A descrição detalhada das proteínas identificadas em estirpes BLAE e ERV pode proporcionar novos alvos para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. Esta abordagem revelou perfis proteicos de bactérias resistentes e em resposta a várias condições de stress antimicrobiano que possibilitaram um maior conhecimento dos mecanismos de resistência associados. A análise proteómica quantitativa em classes específicas de proteínas ou subproteomas em estirpes de ERV e de E. coli produtoras de BLAE abrirá novas perspectivas funcionais no estudo de mecanismos de resistência antimicrobiana facilitando a identificação de marcadores de diagnóstico ou prognóstico e a descoberta de alvos terapêuticos. Conclui-se que a prevalência e disseminação de bactérias indicadoras resistentes aos antimicrobianos, como E. coli e Enterococcus spp., em animais selvagens revelaram que estes podem representar um importante reservatório de bactérias resistentes e de genes de resistência. Este estudo revelou também a presença de estirpes portadoras de genes de virulência, pertencendo a complexos clonais de elevado risco, o que acresce às preocupações de saúde pública que surgem da disseminação de ERV e de E. coli produtoras de BLAE em ecossistemas selvagens.

  • English

    Genomics, proteomics and bioinformatics tools allow for more in-depth knowledge about the physiology and structure of bacteria and also about mechanisms involved in antimicrobial resistance. Antimicrobial resistance, evolving and spreading among bacteria, poses a serious and growing threat to public health. Though, resistance has also been detected in the absence of antimicrobial exposure, such as in bacteria from wildlife, raising a question about the mechanisms of occurrence and persistence of resistant strains under similar conditions, and the implications for resistance control strategies. In order to study antimicrobial resistance in Escherichia coli and Enterococcus spp., 151 faecal samples were collected from three wild animal species, seagulls (Larus cachinnans, 57), common buzzards (Buteo buteo, 42) and red foxes (Vulpes vulpes, 52). Seagull samples were recovered from the Berlengas nature reserve, those of common buzzards from the Peneda Gerês natural park and other rural conservation areas of Portugal and those of red foxes were collected in the north of Portugal during red fox hunts. A total of 111 E. coli (73.5%) and 135 enterococci (89.4%) were isolated from Levine and Slanetz-Bartley plates without antimicrobial agents. After isolation in selective plates supplemented with cefotaxime (CTX) and vancomycin, respectively, the occurrence of extended-spectrum-ß-lactamase (ESBL)-producing E. coli was 12.7% (seagulls, 19.3%; common buzzards, 15.2%; red foxes, 4%) and the prevalence of vancomycin-resistant enterococci (VRE) was 20.4% (seagulls, 10.5%; common buzzards, 36.4%; red foxes, 21.1%). All CTX-resistant E. coli isolates exhibited a resistance phenotype to cefotaxime and/or ceftazidime and had a positive screening test for ESBL production. The most predominant ß- lactamase genes were the blaTEM-52 and blaCTX-M-32 genes (34.8%) together with the blaCTX-M-1 (17.4%), blaSHV-12 (8.7%), blaOXA-1 and blaCTX-M-14a (4.3%) genes. Most of the ESBL and non-ESBL E. coli isolates were multiresistant, with high levels of resistance to tetracycline (57.5%), streptomycin (53%) and sulfamethoxazole/trimethoprim (35.1%), due to the presence of tet(A) and/or tet(B) genes (81.7%), aadA gene (45.1%) and different combinations of sul genes (97.8%), respectively. The most common virulence factor gene was fimA (63.3%) and the majority of the E. coli isolates belonged to phylogenetic groups A (39.1%) and B1 (27.3%). Regarding to the VRE and non-VRE isolates, E. faecium and E. faecalis were the most predominant enterococcal species. High levels of tetracycline and erythromycin resistance were detected and resistance gene profiles were diverse amongst these isolates; the most prevalent genotype was tet(M)+tet(L)+erm(B). Concerning virulence factors, the gelE, hyl, cpd, esp and agg genes were the most predominant. VRE isolates with acquired vancomycin resistance (vanA genotype) were found in 11.3% of the faecal samples analysed; and 9.1% contained VRE isolates with intrinsic vancomycin resistance (vanC1 genotype). The vanA-E. faecium isolates belonged to multilocus sequence types ST273 and ST262 (clonal complex CC17) and also to ST5. ESBL-E. coli and vanA-containing enterococci were also studied through a detailed proteomic approach consisting in two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) followed by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight-mass spectrometry (MALDI/TOF-MS). A total of 686 spots were excised from 2-DE gels of 3 ESBL-E. coli and 4 VRE strains from which 562 proteins were successfully identified (81.9%) and fully characterized through database interrogations. The proteins identified were associated to different biological functions such as glycolysis, transport, biosynthesis, antimicrobial resistance, among others. The results also indicated in E. coli and enterococci strains the presence of proteins involved in stress response, as chaperone proteins DnaK, WrbA, GroEL, among others. Additionally, the VanA protein (Mw: 37419,10938 / PI: 5,79), which prevents vancomycin/teicoplanin binding, was identified when studying the wholecell proteomic profile of vanA-containing enterococci strains. This approach showed that it is possible to evaluate protein profiles in resistant bacteria and in response to antimicrobial stress conditions to further understand the associated resistance mechanisms. Quantitative proteomic analyses on specific protein classes or subproteomes in ESBL-E. coli and VRE strains will provide new functional insights into antimicrobial resistance mechanisms facilitating the identification of diagnostic or prognostic disease markers and the discovery of therapeutic targets. This thesis discussed the prevalence and spread of antimicrobial resistance in indicator bacteria such as E. coli and enterococci in wild animals and showed that wildlife may be an important reservoir of antimicrobial-resistant bacteria and resistance genes. Moreover, this research showed the presence of strains carrying virulence factor genes and belonged to high-risk clonal complexes, which adds to the public health concerns that arise from the spread of ESBL-E. coli and VRE into wildlife.