Bases estructurales de la regulación por nitrógeno mediada por la proteína señalizadora PII

• Autores: Carles Palanca García
• Directores de la Tesis: Vicente Rubio Zamora (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2016
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Luis Ramos Martín (presid.), Ignacio Fita Rodríguez (secret.), Asunción Contreras de Vera (voc.)
• Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Bioquímica y Biomedicina
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TESEO  RODERIC 
• Resumen

  • La asimilación del nitrógeno en plantas, bacterias y arqueas está controlada por la proteína señalizadora PII (Merrick y Edwards, 1995). Esta proteína está altamente conservada en todos los dominios de la vida (Leigh y Dodsworth, 2007) y se descubrió originalmente como reguladora indirecta de la glutamina sintetasa (Stadtman, 2001). PII controla la asimilación de nitrógeno formando complejos proteícos con canales de amonio (Conroy y cols., 2007), enzimas (Llácer y cols., 2007) o reguladores transcripcionales (Llácer y cols 2010). Para ello utiliza sus flexibles lazos T, que son capaces de adoptar diferentes conformaciones (Forchhammer, 2008). Los lazos T están sujetos a modificaciones post-traduccionales de uridililación o adenililación en un residuo conservado de tirosina (catalizadas por el enzima bifuncional GlnD, en bacterias) o fosforilación en una serina (catalizada por una quinasa desconocida, en cianobacterias). GlnD es un enzima bifuncional que cataliza tanto la uridililación como la desuridililación de PII en función de los niveles de nitrógeno, dado que la unión de glutamina (indicador de la abundancia de N) determina el tipo de actividad de la enzima. Por otro lado, PII une como ligandos ATP y ADP, que compiten por un mismo sitio, así como 2-oxoglutarato (2OG), esqueleto carbonado utilizado en la síntesis de glutamato. De esta manera, las proteínas PII actuan como sensores de la carga energética (por la unión de ATP/ADP) y señalizan la abundancia de nitrógeno (tanto por su estado de uridililación como por la unión de 2OG). Hemos enfocado este trabajo de tesis en tres ámbitos. Primero hemos estudiado las proteínas PII de la arquea Haloferax mediterranei, organismo de gran interés no solo por su carácter halófilico sino por ser uno de los pocos donde se ha descrito una interacción directa entre las proteínas PII y la glutamina sintetasa. También hemos caracterizado estructuralmente una diana de PII adenililada en Corynebacterium glutamicum, AmtR, el regulador global del nitrógeno en este organismo. Finalmente hemos realizado una aproximación estructura esclarecer las consecuencias de la uridililación de PII de Escherichia coli. Para comprender como la proteína PII se adapta a condiciones de alta salinidad, hemos determinado las estructuras cristalinas de GlnK2 de H. mediterranei, una de las dos proteínas PII de este organismo, en complejo con AMP, ADP, ATP o sin nucleótido añadido a 1,49 Å, 1,45 Å, 2,60 Å y 1,81 Å de resolución, respectivamente. Un rasgo distintivo de estas estructuras es la presencia de una extensión N-terminal de 11 residuos, rica en residuos ácidos y que no se encuentra en otras PII previamente estudiadas. Esta extensión, contribuye a disminuir el pI de la proteína, un rasgo de haloadaptación y a formar complejos con otras proteínas PII dentro del cristal en complejo con ATP, lo que sugiere que puede tener un papel en la formación de complejos con otras proteínas. Hemos encontrado que extensiones similares están presentes en otras proteínas PII de arqueas halofílicas, lo que refuerza la hipótesis de que se trata de un rasgo de adaptación a la salinidad. GlnK2 de H. mediterranei tiene también otros rasgos bien conocidos de haloadaptación como la sustitución de residuos grandes por otros más pequeños y la mayor relación entre superficie polar y no polar de todas las proteínas PII de estructura conocida. La estructura de GlnK2 ha sido resuelta en complejo con un ligando no habitual de las proteínas PII, AMP. Mediante ensayos de unión, hemos determinado que AMP se une con una fuerza comparable a la del ADP y el ATP, por lo que es posible que las proteína PII de H. mediterranei sean sensibles a AMP, un hecho que debería de explorarse también en otras arqueas. La estructura de GlnK2 también revela una nueva conformación del lazo T, que se organiza parcialmente en ?-hélice, en el cristal con ATP. Esta nueva forma del lazo de interacción con otras proteínas, puede tener relevancia en el complejo descrito entre las proteínas PII y la glutamina sintetasa descrito en H. mediterranei (Pedro-Roig y cols., 2013) C. glutamicum es una bacteria usada en la producción industrial de aminoácidos, por lo que la comprensión de sus rutas metabólicas tiene un gran interés biotecnológico. En este organismo, la expresión de los genes responsables de la asimilación del nitrógeno está bajo el control del regulador global AmtR. AmtR es un represor transcripcional de la familia TetR que, en vez de ser controlado por la unión de una molécula pequeña, como es habitual en esta familia, se libera del DNA y permite la transcripción génica cuando forma un complejo con la forma triadenililada de PII (Beckers y cols., 2005). En este trabajo de tesis describimos las estructuras de este regulador en su forma apo (a 2,25 Å y 2,65 Å) y unida al DNA (a 3 Å de resolución). Las estructuras confirman la pertenencia de AmtR a la familia de TetR y revelan rasgos estructurales únicos quizá relacionados con la formación de un complejo con la proteína PII. Entre estos rasgos se encuentran una hélice 4 de conformación variable, la presencia exclusiva de una hélice extra C-terminal y la existencia de un gran lazo que conecta las hélices 8 y 9 y que tiene similtudes con el lazo T de PII. AmtR también tiene unas extensiones N-terminales de 19 residuos ricas en argininas que se encuentran desordenadas en ausencia de DNA. De hecho, para la unión a su DNA diana, el dímero de AmtR utiliza no solo sus hélices 3 y 3' de sus dos dominios HTH, sino también dichas extensiones que se insertan en dos surcos menores del DNA y que son esenciales para que se pueda dar el complejo, como demuestran los ensayos de retraso de mobilidad electroforética en gel con mutantes con la extensión delecionada. La inserción de estos dos elementos de AmtR en surcos adyacentes del DNA explican la especificidad de secuencia por la caja de unión de AmtR. Finalmente, en el último capítulo de resultados de este trabajo se describen nuestros esfuerzos en caracterizar las consecuencias estructurales de la uridililación de PII de E. coli. Para ello, uridililamos in vitro la proteína PII de E. coli utilizando el enzima GlnD producido de manera recombinante. El seguimiento del grado de uridililación de la proteína se realizó por espectrometría de masas y por electroforesis en condiciones no desnaturalizantes, revelando la uridililación de la totalidad de las moléculas de PII. Conseguimos cristalizar y resolver esta muestra PII-UMP, donde los lazos T uridililados se encuentran móviles en la estructura, lo que sugiere que la uridililación de PII no ordena dichos lazos. La proteína cristalizada tiene ATP unido y en el trabajo se describen las diferencias entre las diferentes formas de PII en complejo con nucleótido así como un modelo que relaciona la unión de ligandos a PII con la conformación de sus lazos T.