Resumen de Caracterización de la disintegrina antiangiogénica jerdostatina. Generación de un modelo transgénico animal
Determinados venenos de serpientes contienen antagonistas específicos de integrinas llamados disintegrinas. Dentro de la familia de las disintegrinas encontramos las disintegrinas cortas monoméricas que contienen un tripéptido (R/K)TS en el bucle de unión a integrinas y que bloquean selectivamente la interacción de la integrina ?1?1 a colágenos tipo I y IV. Concretamente, nuestro estudio se centra en jerdostatina, una disintegrina con motivo RTS, que fue expresada de forma recombinante a partir de una librería de ADNc de la glándula de veneno de Protobothrops jerdonii. La integrina ?1?1 se encuentra expresada en las células endoteliales y en las células del músculo liso vascular, principales componentes celulares de los vasos sanguíneos, implicadas en el mantenimiento de la integridad vascular. Por lo tanto, el uso de las disintegrinas (R/K)TS, antagonistas específicos de ?1?1, permitiría evaluar no sólo la actividad del inhibidor si no también la importancia de dicho receptor en las células donde se expresan. En este trabajo de Tesis Doctoral, se evaluó la capacidad inhibidora de jerdostatina y los resultados obtenidos permitieron postular un modelo de interacción integrina-jerdostatina. Posteriormente, realizamos estudios de la actividad de jerdostatina recombinante sobre la adhesión, migración y proliferación de células del músculo liso vascular sobre colágeno, así como ensayos sobre la actividad antiangiogénica, mediada por factores de crecimiento (VEGF). Nuestros estudios destacan la relevancia funcional de la integrina ?1?1 en las adhesiones focales y hace hincapié en la utilidad de inhibidores específicos de la integrina ?1?1 y ?2?1 como posibles herramientas moleculares antiangiogénicas y para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. La posibilidad de frenar la expansión de las células tumorales bloqueando la angiogénesis se ha revelado como una de las estrategias más prometedoras en la lucha contra determinados tumores sólidos. Así, el desarrollo de un modelo transgénico animal que exprese jerdostatina, de forma condicional en el órgano portador de un tumor, permitiría caracterizar más en profundidad la actividad de jerdostatina en la detención de la progresión tumoral y determinar su papel fisiológico. Para desarrollar un sistema de expresión condicional, nos basamos en el sistema Cre/LoxP y la recombinación homóloga. De esta forma, una vez insertado correctamente el transgén, solamente tras la escisión de los sitios loxP por la recombinasa Cre se producirá la expresión de jerdostatina bajo el dominio del promotor endógeno y ubicuo Rosa26, generando así, un modelo animal transgénico para la expresión condicional de jerdostatina Una vez probada in vitro la expresión y secreción en células de mamífero, se generó la línea transgénica B6; 129P2-Tg(ROSA) 26Sortm1(EGFP,Jerdostatina)Upme. Con el fin de expresar jerdostatina, nuestro ratón transgénico se cruzó con dos líneas transgénicas: Tg Cre-ERT2 y Tg NES-Cre. A su vez, se analizaron fibroblastos extraídos de embriones transgénicos, transfectados con el vector pCre-IRES-PuroR. Los resultados tanto en el modelo celular como animal sugieren que, tras la recombinación, se inicia la transcripción a ARNm pero este debe de sufrir algún tipo de regulación, procesamiento o degradación que impide que se produzca la traducción Certain snake venoms contain specific integrin antagonists, called disintegrins. Within the family of the disintegrins, the short monomeric (R / K) TS disintegrins selectively block the interaction of ?1?1 integrin to collagen types I and IV. Specifically, our study focuses on jerdostatin, a RTS disintegrin, which was recombinantly expressed from a cDNA library of the venom gland of Protobothrops jerdonii. Integrin ?1?1 is highly expressed in endothelial cells and in vascular smooth muscle cells, that are the major cellular components of the blood vessels, involved in the maintenance of the vascular integrity. Therefore, with the use of ?1?1 specific antagonists, we evaluated not only the inhibitor activity but also the importance of the receptor in the vascular cell components. Jerdostatin inhibitory capacity was analyzed and the results allowed to generate a integrin-jerdostatina interaction model. Subsequently, we conducted studies of the activity of recombinant jerdostatina on adhesion, migration and proliferation of smooth muscle cells on collagen and antiangiogenic assays. Our studies highlight the functional relevance of integrin ?1?1 in focal adhesions and emphasizes the use specific inhibitors of integrin ?1?1 and ?2?1 as potential antiangiogenic agents. Moreover, the use of disintegrins as molecular tools for the treatment of cardiovascular diseases. The ability to stop tumor spreading by blocking angiogenesis has emerged as one of the most promising strategies in the fight against certain solid tumors. Thus, the development of a transgenic animal model carrying a tumor, expressing conditionally jerdostatin, would characterize in more depth jerdostatin activity in arresting tumor progression and determine its physiological role.To develop a system of conditional expression, we rely on the Cre / loxP system and homologous recombination. Thus, once the transgene is correctly inserted, expression of jerdostatin will only occur after excision of the loxP sites by the Cre recombinase, thus generating a transgenic animal model for the conditional expression of jerdostatin. Once tested in vitro expression and secretion in mammalian cells, the transgenic line was generated: B6; 129P2-Tg (ROSA) 26Sortm1 (EGFP, Jerdostatina) Upme. In order to express jerdostatina, our transgenic mouse was crossed with two transgenic lines: Cre-ERT2 Tg and Tg NES-Cre. In turn, embryonic fibroblasts from jerdostatin transgenic mice were transfected with pCRE-IRES-PuroR vector and analyzed.The results, both in cells and transgenic animal models, suggest that, after recombination, transcription of mRNA initiates but this must undergo some form of regulation, processing or degradation which prevents translation.
