Citrus defense responses against tetranychus urticae
- Autores: Blas Agut Capdevila
- Directores de la Tesis: Josep-Anton Jacas Miret (codir. tes.), Víctor Flors (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Jaume I ( España ) en 2015
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ramón Albajes García (presid.), Mª Victoria Pastor Fuentes (secret.), Juan Antonio López Ráez (voc.)
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- Resumen
Introducción España es el mayor productor de cítricos de la Unión Europea y del mundo para consumo en fresco, con una producción anual superior a los 5 millones de toneladas durante los últimos años. Por tratarse de un producto consumido preferentemente en fresco, cualquier daño producido en el fruto lo devalúa económicamente, siendo muy importante el control de las plagas directas. La araña roja Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) es un ácaro plaga que se considera clave, causando el mayor daño cuando ataca a los frutos (Pascual-Ruiz et al., 2014). En la actualidad el principal método de control contra T. urticae se basa en la aplicación de acaricidas (Marcic, 2012). Sin embargo, el control químico no siempre es eficaz, debido a la gran capacidad que presenta T. urticae para desarrollar resistencia a diferentes tipos de materias activas (Van Leeuwen et al., 2008). Recientemente, se han desarrollado diferentes métodos de control alternativos, como puede ser el uso de cubiertas vegetales para mejorar su control biológico mediante ácaros fitoseidos, los principales depredadores de T. urticae (Aguilar-Fenollosa et al., 2012.).
El estudio de los mecánismos de defensa de las plantas puede ayudar a desarrollar nuevas técnicas y herramientas para mejorar el control de agentes bióticos. Las plantas son resistentes a la mayoría de artrópodos herbívoros y hongos fitopatógenos debido a las barreras mecánicas que interponen a su ataque, como la cutícula, tricomas, espinas, etc.. Sin embargo, esto no siempre es suficiente. Algunos artrópodos son capaces de superar esas defensas y ocasionar daño a la planta. En el caso de T. urticae el daño que causa a la planta se traduce enuna reducción de la tasa de fotosíntesis y un aumento de la transpiración, debido su alimentación de las células del mesófilo de las hojas a través de sus estiletes, extrayendo su contenido celular (Johnson and Lyon, 1991). Además, en casos como el de los cítricos, el daño aparece también en los frutos, donde el ataque se traduce en la aparición de manchas negruzcas que pueden depreciar enormemente el valor comercial del fruto (Ansaloni et al., 2008).
Para iniciar la respuesta de defensa, la planta debe reconocer eficazmente al atacante. Para ello, la planta presenta unos receptores que reconocen estructuras moleculares asociadas a herbívoros. La activación de estos receptores hace que se inicie una cascada de señalización hasta la producción de compuestos tóxicos para el atacante. Diversos autores han demostrado que la principal ruta de señalización para una respuesta de defensa eficaz contra T. urticae es la ruta del ácido jasmónico (Kant et al., 2004; Zhurov et al., 2014). Sin embargo, la naturaleza química de los compuestos con efectos perjudiciales sobre la araña roja es diferente según la especie vegetal de que se trate (Agut et al., 2014; Zhurov et al., 2014), incluyendo inhibidores de proteinasas, glucosinolatos o acil-azucares, para los que se ha demostrado un efecto negativo sobre el desarrollo de T. urticae.
En determinadas ocasiones, este tipo de defensa química directa no es del todo eficaz.La planta también puede responder liberando una mezcla de compuestos volátiles que pueden presentar diferentes funciones: atraer a enemigos naturales que se alimentan del fitófago, repeler al fitófago, y avisar a las plantas vecinas o a partes distales de la misma planta de un posible futuro ataque (Dicke and Baldwin, 2010). En el caso de la araña roja, dos compuestos volátiles, ocimeno y metilsalicilato, parece que son los responsables de la atracción de ácaros fitoseidos, el grupo de depredadores considerado más eficaz contra T. urticae (Zhang et al., 2009; Ament et al., 2010).
Las variedades comerciales de cítricos se multiplican vegetativamente injertandolas en un patrón. Esto puede proporcionar a la planta resistencia a diferentes factores ambientales tanto bióticos como abióticos. Bruessow y colaboradores (2011) demostraron que la respuesta de defensa de los cítricos frente a esta plaga estaba mediada por el patrón. Injertando el mismo cultivar sobre diferentes patrones observaron diferentes desarrollo de la araña, siendo la variedad injertada sobre naranjo amargo la que mostró mayor nivel de resistencia mientras que el mandarino Cleopatra fue el que indujo mayor susceptibilidad, sugiriendo la existencia de algún tipo de señal sistémica que viaja desde la raíz a las hojas.
En esta investigación, se pretende dilucidar los principales mecanismos de defensa directa en cítricos mediante el uso de cromatografía líquida acoplada a un cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) para la detección de compuestos con capacidad acaricida. Asimismo, se ha determinado el papel que juegan los volátiles liberados en respuesta al ataque, usando la cromatografía de gases para la detección de estos compuestos . Por último, se ha abordado el estudio de las señales sistémicas de las hojas a la raíz y viceversa para determinar la señal móvil que envía el patrón hacia la variedad en respuesta al ataque de T. urticae.
Esta investigación ha generado el conocimiento de nuevos compuestos naturales con potencial actividad acaricida y repelente de la propia plaga que combinados adecuadamente pueden conducir en un futuro a nuevos métodos para el control de la araña roja que permitan reducir el uso de plaguicidas químicos de síntesis y desarrollar programas de protección integrada de cultivos con un uso mínimo de plaguicidas en cítricos.
(Todas las referencias se encuentran en las referencias de los capítulos posteriores) Objetivos El objetivo general de la investigación es dilucidar los principales mecanismos de defensa de los cítricos frente al ataque de T. urticae.
Los objetivos concretos son: 1. Determinar rutas metabólicas y compuestos responsables de la defensa mediante la realización de bioensayos de resistencia directa con patrones de cítricos con diferente nivel de susceptibilidad a la araña roja. Desarrollado en el Capítulo 2.
2. Estudiar la comunicación química planta-planta en respuesta a la infestación por T. urticae. Para ello, se determinarán los compuestos volátiles liberados por los patrones en presencia de T. urticae, y se analizarán el papel que juegan estos volátiles en la promoción de respuestas en cítricos adyacentes no infestados, así como en la elección del huésped por T. urticae. Desarrollado en el Capítulo 3.
3. Identificar las señales sistémicas transmitidas desde el patrón a la variedad en respuesta a la infestación, utilizando el cultivar Clemenules injertado sobre patrones de cítricos con diferente nivel de susceptibilidad a la araña roja. Desarrollado en el Capítulo 4.
Metodología general - Experimentos planta-artrópodo Para profundizar sobre los mecanismos de resistencia de cítricos frente a la araña roja se han realizado estudios tanto con patrones de dos meses de edad como con plantas del cultivar Clemenules injertado sobre diferentes patrones. Se utilizaron dos patrones con diferente nivel de respuesta al ataque de T. urticae, naranjo amargo y mandarino Cleopatra. Con estos dos fenotipos distintos se analizaron las posibles rutas metabólicas y compuestos responsables de la resistencia a la araña roja.
- Bioensayos de elección Para observar el efecto de los volátiles liberados por los patrones en presencia de la plaga se realizaron ensayos de elección con un olfactómetro. Los ensayos de elección se llevaron a cabo mediante la introducción de aire filtrado en el sistema. Los volátiles liberados por las plantas en respuesta a la infestación se hicieron pasar por un tubo en Y para forzar la elección de las arañas en función de la diferente composición de gases emitidos por los patrones.
- RT-qPCR La expresión génica de los genes de interés se llevó a cabo mediante la técnica de cuantificación de mRNA tras su conversión a cDNA y amplificación mediante cebadores específicos de los genes estudiados, comparando su expresión con los genes constitutivos GAPDH y EF1. Mediante el análisis de la curva de melting se comprobó la pureza del producto amplificado.
- Cromatografía líquida y gaseosa Las muestras vegetales obtenidas de los diferentes experimentos se prepararon para el análisis por cromatografía líquida mediante homogeneización y posteriormente se centrifugaron y se purificaron mediante partición en fase orgánica, desecado, resuspensión en el disolvente apropiado y posterior filtrado.
El desarrollo de todas las técnicas de cromatografía líquida se realizó combinando dos equipos por un lado un Waters Acquity LC (UPLC-TQD; Waters, http://www.waters.com) para las búsquedas dirigidas, y por otro lado, Waters Acquity acoplado a un detector de masas/masas cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF MS) para las busquedas no dirigidas.
En cuanto a la cromatografía gaseosa el instrumental utilizado fue un Agilent 7683 acoplado a un espectometro de masas de tiempo de vuelo GCT (Waters Corporation).
Resumen En la presente tesis doctoral se han estudiado los mecanismos de defensa de cítricos frente al ataque de T. urticae a diferentes niveles. En primer lugar se analizaron los mecanismos de defensa directa utilizando dos patrones con diferente nivel de susceptibilidad. Se llegó a la conclusión de que la ruta de defensa del ácido jasmónico (JA) es la efectiva frente a la araña roja. Mediante análisis metabolómicos se observó una gran acumulación de diferentes flavonoides como naringenina o hesperetina en el patrón más resistente. Estos flavonoides con posible actividad acaricida posiblemente estén regulados por la ruta JA, fenómeno que se ha confirmado en otras especies vegetales. A continuación se estudió si los volátiles liberados por los cítricos tenían algún efecto sobre las plantas vecinas o sobre el propio fitófago. Los experimentos demostraron que los volátiles del patrón resistente naranjo amargo infestado con T. urticae eran capaces de inducir resistencia en el patrón susceptible mandarino Cleopatra y además que estos volátiles creaban un efecto de repelencia en el fitófago. Se observó que T. urticae evitaba las plantas de naranjo amargo previamente infestadas por conspecíficos. La identificación y cuantificación de los volátiles indicó que estos efectos eran causados por limoneno, ocimeno y 4-hidroxi-4-metil-2-pentanona. La última parte del trabajo se basó en estudios sistémicos para tratar de dilucidar las señales que eran transmitidas desde el patrón a la variedad. Se muestreó el eflujo de la raíz en plantas de la variedad Clemenules injertadas sobre los dos patrones ya citados. Posteriormente el análisis metabolómico de estas muestras indicó que el ácido glutámico parecía ser la señal que se transporta desde el patrón hasta la variedad.
