Desarrollo de electrodos modificados con polímeros conductores y nanopartículas para la determinación de actividad antioxidante. Aplicación en agroalimentación
- Autores: María del Pilar Rivas Romero
- Directores de la Tesis: José Miguel Rodríguez Mellado (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rafael Rodriguez Amaro (presid.), Enrique Fatás Lahoz (secret.), Carlos Fernández Lledo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Electroquímica. Ciencia y Tecnología por la Universidad Autónoma de Barcelona; la Universidad Autónoma de Madrid; la Universidad de Alicante; la Universidad de Barcelona; la Universidad de Burgos; la Universidad de Córdoba; la Universidad de Lleida; la Universidad de Murcia; la Universidad de Sevilla; la Universidad Politécnica de Cartagena y la Universitat de València (Estudi General)
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- Resumen
DESARROLLO DE ELECTRODOS MODIFICADOS CON POLIMEROS CONDUCTORES Y NANOPARTICULAS PARA LA DETERMINACION DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE. APLICACIÓN EN AGROALIMENTACION.
El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis:
1. Introducción o motivación de la tesis La motivación de la presente Tesis Doctoral, surge a raíz del interés de la industria alimentaria que persigue potenciar sabores o aromas de los alimentos con el fin de agradar al consumidor.
Esto se logra adicionando aditivos alimentarios, los cuales pueden ser antioxidantes naturales o bien sintéticos. Dichos aditivos están regulados por ley puesto que un consumo excesivo de ellos propicia la aparición de radicales libres, como pueden ser las especies reactivas de oxígeno (ROS), los cuales son responsables de estrés oxidativo que sufre el ser humano (y en general los organismos pluricelulares) a nivel celular como consecuencia de la producción de radicales libres procedentes de fuentes endógenas (propias del organismo) y exógenas (malos hábitos alimentarios, tabaco y un largo etcétera) y los daños que ocasionan de forma directa a las células dando lugar a numerosas enfermedades. Es aquí donde se destaca la importancia del consumo de antioxidantes naturales para paliar el efecto de dichos radicales. El gran interés despertado por las industrias alimentarias en el uso de los antioxidantes es debido a que previenen múltiples enfermedades, ya se ha comentado anteriormente.
Los antioxidantes con actividad scavenging (capacidad atrapadora de radicales) previenen la activación de carcinógenos interrumpiendo la propagación de ROS, este fenómeno es conocido como capacidad antioxidante. Tal capacidad ha sido evaluada mediante polarografía pero el inconveniente que presenta dicha metodología es el uso de mercurio debido a su toxicidad y además se trabaja a condiciones no fisiológicas, sino a pH básico.
Con respecto, a los métodos espectrofotométricos establecidos hoy en día, son muy usados, aunque como en el caso anterior, el medio de trabajo es básico, por lo que no se puede extrapolar al medio fisiológico, además, se emplean disolventes orgánicos y éstas dependen de la cinética de reacción.
Como alternativa, se han desarrollado electrodos modificados con polímeros orgánicos conductores, trabajando a partir de sus monómeros como son, anilina y fenazinas (rojo neutro, safranina y fenosafranina) y nanopartículas metálicas (platino y plata), los cuales son, inocuos, se puede trabajar en medios neutros lográndose medidas estables y fiables.
2. Contenido de la investigación Para abordar el objetivo de la tesis, en primer lugar, hay que modificar las superficies electródicas de distintos sustratos. Que en este caso han sido, electrodos de carbón vitrificado (GC), pasta de carbón (EPC), grafito (G), platino (Pt), oro (Au) y electrodos de óxido indio y estaño (ITO). Las superficies de estos electrodos son modificadas electroquímicamente con polímeros orgánicos conductores, tales como polianilina (PANI) y polifenazinas [poli-rojo neutro (PNR), poli-safranina (PS) y poli-fenosafranina (PPs)] y nanopartículas metálicas (MNPs) como han sido platino y plata. Las técnicas empleadas para lograr dichas modificaciones fueron voltametría cíclica para la electropolimerización de los monómeros y mediante cronoamperometría se siguió la electrodeposición metálica a potencial constante. Modificados los electrodos, a continuación, se procede a la monitorización de la señal de reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) mediante voltametría de pulso diferencial.
De los resultados obtenidos a partir de electrodos modificados con PANI y Pt, se ha visto que sobre GC muestra una mejor sensibilidad a la respuesta electroquímica del H2O2 que aquellos resultados obtenidos para grafito, esto puede ser debido a la estructura más ordenada del GC que en el caso del grafito, en la que la respuesta del electrodo con respecto a la concentración de H2O2 no cambia, quizás por la pérdida de conductividad del polímero o bien por el desprendimiento del platino, aunque de todas formas, GC modificado no puede emplearse como sensor ya que su respuesta varía con el tiempo. En cambio, se ha encontrado que el electrodo con mejores prestaciones es el de platino depositado sobre PNR polimerizado sobre un electrodo de GC. Dicho electrodo es estable durante al menos 5 meses de uso continuo. Se ha realizado la optimización de este electrodo en lo que concierne al pH, electrolito soporte, amplitud y velocidad de barrido, etc.
Con el fin de indagar más, como ya se ha comentado, se decidió trabajar con otros polímeros de la familia de las fenazinas. Por consiguiente, seis electrodos de carbón vitrificado fueron modificados con nanopartículas de plata y platino electrodepositadas, los cuales se vio que se tratan de sensores adecuados para llevar a cabo el estudio cuantitativo de la reducción del peróxido de hidrógeno y poder establecer la interacción entre el H2O2 y antioxidantes. De los valores obtenidos de capacidad antioxidante expresados en equivalentes trolox, conseguidos mediante los seis electrodos modificados, se vio que fueron muy parecidos y, además, dichos valores se han contrastado con otras técnicas reportados en la bibliografía. Aquellos electrodos modificados con platino son mejores desde el punto de vista de estabilidad en el tiempo, pero debido al bajo coste de las sales de plata respecto a las sales de platino, los electrodos de plata son una buena opción, aunque el inconveniente es tener que preparar diariamente tales electrodos, como ya se ha visto en el ensayo de estabilidad en el tiempo.
Finalmente, de los aspectos mecanísticos se dedujo gracias a la voltametría de convolución que los fenómenos de adsorción no juegan un papel importante, ya que las curvas J-E a altos sobrepotenciales presentan valores límites, los cuales son muy parecidos a diferentes velocidades de barrido y proporcionales a la concentración del peróxido de hidrógeno. El principal transporte de materia es por difusión. Además, el proceso de reducción del H2O2 es de primer orden siendo o bien irreversible, o bien un proceso donde hay transferencia electrónica seguida de una etapa química (EC). Un posible mecanismo transcurre a través de la formación de radicales HO·.
Una vez desarrollados los electrodos, el siguiente paso es caracterizar las superficies electródicas modificadas mediante “Microscopía de Barrido Electrónico (SEM)” y “Espectroscopía Raman” para conocer la morfología y la distribución de las nanopartículas metálicas y cómo esto influye en la electrocatálisis.
De los resultados obtenidos, se observa que los distintos polímeros orgánicos se distribuyen de manera discreta, esto quiere decir que no recubren la superficie electródica (ITO) en su totalidad, formando una red granular de 799 nm aproximadamente. Posteriormente, de la optimización del tiempo de deposición de platino, en general, parece que sigue el mismo comportamiento. Conforme aumenta dicho tiempo, se ve la formación de grandes clústeres teniendo como consecuencia la pérdida se la señal electrocatalítica debida al peróxido de hidrógeno, mientras que, a bajos tiempos, la catálisis es deficiente. Por consiguiente, lo deseable sería trabajar a tiempos intermedios. Además de esto, se concluyó que los aglomerados sobre el polímero están constituidos por nanopartículas de platino de tamaños entre 10 y 60 nm. Una vez caracterizadas las superficies por ambas técnicas, se procede al estudio del efecto del peróxido de hidrógeno y ácido ascórbico sobre la morfología de las nanopartículas de platino. De las nuevas imágenes SEM, se vio que, en ambas situaciones, el tamaño de las PtNPs disminuye con respecto a las medidas en ausencia de estas especies, siendo menores tras los experimentos con ácido ascórbico, pero los tamaños de las PtNPs se mantienen. Tras la limpieza electroquímica del electrodo se recupera la distribución de agregados previa a los experimentos, lo que justifica la reproducibilidad del sensor.
Sin embargo, en el caso de las AgNPs, se observa en los diferentes tiempos de deposición la aparición de dendritas, además de nanopartículas esféricas de plata. La formación de dichas dendritas afecta considerablemente a las prestaciones del sensor puesto que, debido a problemas en las propiedades mecánicas del mismo, las medidas de monitorización llevadas a cabo no son fiables ni reproducibles ya que, en cada experimento, más materia de plata electrodepositada, se va desprendiendo.
Con respecto a la electrocatálisis del compósito, los resultados espectroscópicos muestran la formación de polarones en el puente intermonomérico del PNR durante los procesos electroquímicos de reducción y oxidación. Estos polarones no se observan en ausencia de platino. Por consiguiente, las nanopartículas de platino estabilizan las estructuras radicálicas. El mecanismo electroquímico propuesto para Pt@PNR incluye la transferencia relativamente rápida de los cationes (aparentemente no son los protones) y la transferencia relativamente lenta de los aniones. Los aniones equilibran la carga de los polarones en el puente intermonomérico. En nuestras condiciones experimentales, esta reacción electroquímica cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno donde Pt@PNR podría actuar como una fuente de átomos de hidrógeno para esta reacción. Además, tanto en la transferencia aniónica como catiónica, incluye la transferencia de agua libre (no estructural). En algunas condiciones experimentales, se propone una transición relativamente rápida de moléculas de agua acoplada con transferencia de cationes y una transferencia relativamente lenta de moléculas de agua en la dirección opuesta de la transferencia de aniones.
Este nanocompuesto híbrido muestra propiedades excelentes como mediador para la reducción del peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, podría usarse como un sensor adecuado para la determinación de H2O2 en muestras reales. A partir de los resultados de este trabajo, se pueden desarrollar experimentos adicionales para maximizar el número de polarones en PNR con la presencia de nanopartículas de Pt (es decir, optimizar la electrosíntesis de nanocompuesto o usar otros aniones como contraiones). Esto podría ser beneficio para otro tipo de analitos cuya catálisis o detección es estimulada por la presencia de especies radicales como polarones.
Por último, aquel electrodo que mostró mejores prestaciones, Pt/PNR/GC, se ha utilizado para medidas en muestras reales, más concretamente en el estudio de compuestos principales activos de especias y condimentos, así como, tés, infusiones y especias, con el fin de determinar la capacidad antioxidante de éstas. Posteriormente, se corrobora mediante las técnicas existentes (DPPH, CUPRAC, Hg) hoy en día establecidas, que Pt/PNR/GC podría ser una alternativa, cumpliendo con el objetivo principal de esta tesis, a la metodología clásica utilizada hasta el momento, puesto que se trata de una técnica limpia, ya que no se emplean disolventes orgánicos, rápida y fiable.
Además del estudio de la capacidad antioxidante de los principios activos de las especias y condimentos, de los resultados obtenidos se concluyó que las capacidades antioxidantes conseguidas por las diferentes técnicas varían de forma similar, es decir, se pueden correlacionar a excepción de la técnica DPPH.
En cuanto a la comparación entre las capacidades antioxidantes de los extractos mediante cada técnica, se dedujo que los cuatro métodos proporcionan el mismo tipo de información. Aunque, se vio que, con respecto a las técnicas electroquímicas, empleando electrodo Hg y PNR, son más específicas para evaluar la capacidad de atrapamiento de radicales secundarios, es decir, se tratan de ensayos tipo HAT, sin embargo, DPPH y CUPRAC, evalúan otras reacciones, es decir, son técnicas que miden reacciones tipo HAT y SET. Por otro lado, se observó que, aunque la muestra presente un alto contenido de antioxidantes totales, no tiene porqué ser el mayor en actividad antioxidante, esto quiere decir que, la naturaleza de las moléculas que forman parte de los extractos es un factor determinante, con independencia del ensayo empleado.
Con respecto a las medidas de los extractos de las especias y condimentos, a la luz de los resultados se pudo afirmar que nuevamente, mediante los cuatros métodos de medida de capacidad antioxidante se consigue prácticamente la misma información. En cuanto a la relación capacidad antioxidante-contenido en antioxidantes totales, se observó de nuevo que un alto contenido total de antioxidantes no quiere decir que se tenga un alto valor de capacidad antioxidante, no es un factor determinante, como se ha comentado en el párrafo anterior.
Por último, Pt/PNR/GC puede utilizarse para determinar la capacidad antioxidante de forma similar al resto de técnicas presentando varias ventajas frentes a las otras técnicas. En comparación con el electrodo Hg, las medidas en PNR se pueden hacer a condiciones fisiológicas, esto es a valores cercanos a pH 7, lo cual en Hg no puede lograrse puesto que las medidas se llevan a cabo a pH > 10. Por otro lado, trabajar con Hg implica trabajar con disolvente orgánico.
Con respecto a CUPRAC, el tiempo de medida es menor, además de no emplear disolventes orgánicos y se puede operar bajo condiciones fisiológicas.
Finalmente, Pt/PNR/GC, es tan sensible como DPPH o CUPRAC para compuesto puros y extractos alimenticios, por consiguiente, se ha cumplido el objetivo de la tesis, se trata de una alternativa a la metodología clásica.
3. Conclusión 1. De los electrodos modificados con PANI, electrodos de carbón y platino, el que presenta mejores características es el polimerizado sobre GC y con platino electrodepositado. Esto puede ser debido a su estructura más ordenada que las de los otros electrodos de carbón utilizados. Aun así, no puede emplearse como sensor ya que su respuesta varía con el tiempo desde la preparación. Además, la respuesta del electrodo de PANI sobre grafito con Pt, no cambia con la concentración de H2O2, quizás por la pérdida de conductividad del polímero o bien por el desprendimiento del platino.
2. Para los electrodos modificados con PNR, electrodos de carbón y platino, el que ofrece una mejor respuesta es el de GC y platino. Se trata un electrodo reproducible y estable por lo que puede ser usado como sensor. Por el contrario, al igual que con PANI, el electrodo de grafito no es adecuado.
3. Con respecto a los electrodos modificados con nanopartículas de platino, la naturaleza del buffer es importante, siendo necesario un medio tamponado para obtener una señal reproducible ligada a la concentración de H2O2, por ejemplo, PBS a una fuerza iónica suficientemente alta, ya que a bajas concentraciones de PBS, o disoluciones de NaCl sin tamponar, el voltagrama incluye una señal de oxidación adicional y se deforma. El pH óptimo de trabajo se encuentra en torno a 7, al cual los valores de intensidad son máximos y el potencial de pico no depende del pH apreciablemente.
4. La amplitud del barrido influye de forma considerable en la respuesta. A potenciales mayores de 0.5-0.6V se propicia la aparición de óxidos de platino que se reducen en el barrido de vuelta. La señal de reducción es mayor conforme el potencial de inicio del barrido es también mayor, la cual interfiere con la señal de reducción del H2O2.
5. A partir de estudios con la balanza electroquímica de cuarzo, se concluye que el número de ciclos óptimo para la polimerización son 10, para el rojo neutro y 15 para safranina y fenosafranina.
6. Los electrodos modificados con nanopartículas de platino, son idóneos para trabajar en un amplio rango de concentraciones. Las intensidades catódicas son elevadas debido al poder catalítico de este metal y son electrodos reproducibles, repetitivos y estables en el tiempo. GC/PNR/Pt presenta mejores prestaciones y además cuenta con una vida útil de 5 meses; el menos estable en el tiempo dentro de este grupo es GC/PPs/Pt que tiene una durabilidad de un mes, mientras que para GC/PS/Pt es de 45 días.
7. Para los electrodos modificados con nanopartículas de plata, tanto el electrodo modificado con GC/PNR/Ag como GC/PS/Ag presentan buenas propiedades para la determinación de capacidad antioxidante, siempre y cuando se utilice en un rango de concentraciones a partir de 2.5 mM de H2O2. Además es un electrodo reproducible y repetitivo, aunque su vida útil es corta. En cambio, con GC/PPs/Ag se pueden utilizar bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno, aunque su vida útil es corta.
8. Los resultados obtenidos de capacidad antioxidante del ácido ascórbico expresados en equivalentes trolox, para los seis electrodos modificados con las polifenazinas y las nanopartículas metálicas platino y plata, sugieren que los mecanismos H2O2-antioxidante-electrodo, son similares, lo cual quiere decir que las ROS generadas en el proceso electroquímico deben ser las mismas para los seis electrodos, lo cual está de acuerdo con los resultados encontrados en la bibliografía. Los seis electrodos son adecuados para los estudios cuantitativos de este trabajo. Aunque los electrodos modificados con PtNPs son mejores desde el punto de vista de la estabilidad, los modificados con AgNPs son una buena alternativa ya que las sales de plata son menos costosas que las de platino, pero habría que prepararlos diariamente.
9. La voltametría de convolución indica que los fenómenos de adsorción no juegan un papel importante y que el principal transporte de materia es por difusión. El proceso de reducción del H2O2 es de primer orden siendo o bien irreversible, o bien un proceso donde hay transferencia electrónica seguida de una etapa química (EC). Un posible mecanismo transcurre a través de la formación de radicales HO•.
10. Las polifenazinas no se electrodepositan de manera homogénea, es decir, su distribución es discreta. Poseen una morfología montañas-valles, formando una red granular donde el diámetro medio de los granos del polímero es de 799 nm presentando bajas polidispersidades.
11. Los resultados de SEM-EDX y espectroscopía Raman Superficial confirman la presencia de polímero en el sustrato. Al aumentar el tiempo de deposición del metal, el polímero se va dopando progresivamente, pero las nanopartículas metálicas no recubren al polímero en su totalidad. En el caso del platino, a 120s se forman clústeres que provocan una pérdida en la señal electrocatalítica del peróxido de hidrógeno. Para la plata, a un tiempo de 120s gran parte del depósito se desprende debido a que el polímero no es capaz de soportar la gran cantidad de Ag alojada en el mismo. En ambos casos.
12. Las nanopartículas se encuentran en las cavidades del polímero y sobre los aglomerados poliméricos. Las de platino sobre PNR tienen un diámetro de 10-60 nm. La morfología, tamaño y sitios que ocupa el platino confieren al sensor las propiedades electrocatalíticas. Las nanopartículas de plata también se encuentran en las cavidades y sobre dichos aglomerados, aunque en este caso se forman además dendritas.
13. La presencia de las nanopartículas metálicas, provoca una atenuación de las bandas del polímero y en la región 35-410 cm-1 / 215-240 cm-1, aparece la vibración de los óxidos o hidróxidos de platino y plata, respectivamente.
14. Al someter el sensor al sistema electroquímico, registrando la señal de reducción de H2O2 y H2O2-AA, el tamaño de las nanopartículas disminuye. Cuando se realiza la limpieza electroquímica, el electrodo recupera la distribución de los agregados lo que justifica la reproducibilidad.
15. El menor su coste de la plata respecto al platino es una ventaja, además de que el bajo potencial de reducción del H2O2 evitan solapamientos con las señales de los antioxidantes. Estas ventajas hacen que compense trabajar con estos electrodos aunque sea necesario prepararlos diariamente.
16. De los resultados espectroscópicos, el nanocomposite híbrido Pt@PNR muestra la formación de polarones en los enlaces intermonoméricos del polímero durante los procesos electroquímicos de reducción y oxidación. Estos polarones no se observan en ausencia de platino. Por consiguiente, las PtNPs estabilizan a estas estructuras radicálicas.
17. El mecanismo electroquímico propuesto para Pt@PNR incluye una transferencia de cationes relativamente rápida (aparentemente no son H3O+) and y una transferencia de aniones relativamente lenta. Los aniones equilibran las cargas de los polarones en los enlace intermonoméricos. En las condiciones experimentales llevadas a cabo, Pt@PNR podría actuar como fuente de átomos de hidrógeno para la catálisis de reducción del H2O2. Además, ambas transferencias iónicas incluyen agua libre (no estructural).
18. Este nanocomposite híbrido Pt@PNR muestra excelentes propiedades como mediador para la reducción de H2O2. Por consiguiente, podría usarse como sensor para la determinación de H2O2 en muestras reales.
19. Las diferentes técnicas usadas, método DPPH y CUPRAC (ambos métodos son espectrofotométricos), electrodo Hg y PNR (ambos métodos electroquímicos), establecen la actividad antioxidante de los principios activos de los alimentos estudiados en esta Tesis.
20. Las técnicas DPPD y CUPRAC evalúan reacciones HAT-ET, mientras que electrodo Hg y PNR establecen reacciones HAT.
21. Un alto nivel de antioxidantes totales no quiere implica necesariamente una alta actividad antioxidante, es decir, la naturaleza de las moléculas que forman parte de los extractos es un factor determinante para la capacidad antioxidante.
22. Las medidas obtenidas mediante PNR reducen el tiempo de respuesta y más fácil su manipulación con respecto al resto de métodos, además, las medidas se realizan en condiciones fisiológicas (pH 7 y medio acuoso).
23. El sensor puede estudiar antioxidantes o extractos sin actividad en el método DPPH.
24. PNR es al menos tan sensible como DPPH o CUPRAC, tanto para compuestos puros como extractos de tés, infusiones y condimentos.
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