Association study of phenology, yield and quality related traits in table grapes using SSR and SNP markers

• Autores: Belkacem Zarouri
• Directores de la Tesis: María Teresa de Andrés Domínguez (codir. tes.), José Antonio Cabezas (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Politécnica de Madrid ( España ) en 2016
• Idioma: inglés
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Archivo Digital UPM
• Resumen
  • español

    Las últimas innovaciones en tecnologías de genotipado de alto rendimiento y la disponibilidad de grandes colecciones de germoplasma han impulsado la realización de estudios de asociación conocidos como “Genome-Wide Association Studies” (GWAS) en las especies cultivadas. Sin embargo, hasta la fecha no se han llevado a cabo trabajos que evalúen la utilidad de este tipo de estrategias en la vid (Vitis vinífera L.). En este estudio nos propusimos a comprobar la utilidad del GWAS para análisis genético en la vid, empleando para ello la colección del banco de germoplasma de vid de El Encín (Alcalá de Henares, Madrid, España) y dos aproximaciones: utilizando por un lado marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) en alta densidad; y por otro una baja cobertura de marcadores microsatélites (SSR; Simple Sequence Repeat). Una colección de 274 accesiones de vid, que representa gran parte de la diversidad genética existente en la vid cultivada se genotipó empleando la estrategia de Genotyping by Sequencing (GBS), lo que permitió identificar un total de 358.454 SNPs distribuidos a lo largo de todo el genoma. El proceso de filtrado de datos permitió obtener un set de 36.332 SNPs de alta calidad para 242 individuos, con una frecuencia mínima del alelo minoritario (MAF) de 0,01 y una proporción media de datos perdidos del 12%. Por otro lado, se desarrolló un panel de PCRs (Polymerase Chain Reaction) multiplex que permite analizar 264 marcadores SSRs distribuidos a lo largo del genoma de la vid empleando sólo 45 reacciones de PCR. La información genética y alélica generada en este estudio (rangos de amplificación, parámetros de diversidad, presencia de alelos nulos, facilidad de genotipado) será de gran utilidad para seleccionar los marcadores SSRs más adecuados para futuros estudios genéticos en la vid. Los estudios de tipo GWAS se fundamentan en los patrones de distribución del desequilibrio de ligamiento (LD) a lo largo del genoma. En este trabajo hemos analizado los patrones de distribución del LD lo largo del genoma de la vid empleando tanto marcadores de tipo SNPs como microsatélites. Los resultados demostraron que el LD basado en SNPs decae drásticamente (r2 = 0.2) dentro de una distancia media de 1 kb, aunque se observó una variación considerable entre cromosomas (de 0,03 a 6,79 kb). Por lo tanto, para desarrollar GWAS con alta fuerza de detección en la vid sería necesario utilizar millones de SNPs (ex. 3.5 millones para r2 = 0.2). Aunque el análisis con SSRs no permitió obtener estimas fiables del decaimiento del LD a lo largo de todo el genoma debido a la insuficiente densidad de marcadores, los resultados indican que el LD basado en SSRs no se extendería mucho más que el LD basado en SNPs. El GWAS desarrollado basado en SNPs permitió detectar asociaciones con una significación muy alta (corrección de Bonferroni P < 1.4 x 10-6) para caracteres de herencia sencilla o moderadamente compleja (como el color de la baya, el sexo de la flor, el sabor amoscatelado, la apirenia, o el tamaño de bayas). Muchas de estas asociaciones se localizan con regiones en las que estudios anteriores habían ya identificado QTLs (Quantitative Trait Loci), confirmando así la validez de los resultados obtenidos, mientras que otras corresponden a nuevos QTLs no identificados hasta la fecha. Se detectaron también posibles asociaciones para caracteres complejos, como la fecha de maduración, arquitectura del racimo o la forma y firmeza de la baya. Sin embargo, no se detectaron asociaciones para otros caracteres complejos, como fertilidad o fecha de floración. El análisis de asociación basado en SSRs mostró un menor poder de detección que el GWAS basado en SNPs. Aun así, permitió detectar varios QTLs de efecto principal ya identificados en estudios anteriores mediante mapeo de QTLs, así como confirmar varias de las asociaciones encontradas en el análisis con SNPs y proporcionar pruebas de nuevas asociaciones. Como conclusión, el trabajo desarrollado en esta Tesis doctoral demuestra el potencial que los estudios de asociación pueden tener para la identificación de regiones génicas implicadas en el control de la expresión de caracteres relevantes en la vid, poniendo de manifiesto sus fortalezas, pero también puntos débiles, que deberían ser objeto de especial consideración en futuros proyectos de GWAS.

  • English

    The advent of cheaper high throughput genotyping technologies and the availability of large germplasm collections encouraged the extension of Genome-Wide Association Studies (GWAS) to crop plants. However, to date these strategies have not yet been tested in grapevine (Vitis vinífera L.). Taking advantage of the availability of a large grapevine germplasm collection maintained at the germplasm bank of El Encín (Alcalá de Henares, Madrid, Spain) and the relatively affordable genotyping tools, we proposed in this study to assess the feasibility of GWAS in grapevine, using both a high density Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) dataset and a sparse Simple Sequence Repeats (SSRs) coverage. A diversity panel of 274 grapevine accessions representing most of the cultivated grapevine gene pool has been genotyped using the Genotyping by Sequencing strategy (GBS). A total of 358,454 genome-wide distributed SNPs have been identified. After filtering, a reliable dataset of 36,332 SNPs across 242 individuals with a minimum minor allele frequency (MAF) of 0.01 and an average missingness of 12% has been obtained. On the other hand, we developed a panel of multiplex PCRs (Polymerase Chain Reaction) that allowed to genotype the mapping collection for 264 genome-wide distributed SSR markers using only 45 PCRs and sequencer runs. The genetic information generated in this study (allele size ranges, diversity parameters, presence of null alleles and ease of scoring) will serve as the basis for the identification of the most suitable loci for future microsatellite-based genetic studies in grapevine. GWAS relies on Linkage Disequilibrium (LD) to detect genotype-phenotype associations. LD across the grapevine genome was examined using both GBS-SNPs and SSR markers. SNP-based LD decayed drastically to r2 = 0.2 within an average distance of 1 kb, with considerable variation among chromosomes (from 0.03 to 6.79 kb), indicating that millions of SNPs would be needed to perform high powered GWAS (ex. 3.5 million for r2 = 0.2). Although the set of SSR markers did not allow to obtain reliable estimates of LD decay throughout the genome because of insufficient marker density, the results points that SSR-based LD would not extend much more than SNP-based LD. SNP-based GWAS permitted to identify (at the Bonferroni-corrected threshold (P < 1.4 x 10-6)) genetic associations for simply to moderately inherited traits such as berry color, flower sex, muscat flavor, seedlessness or berry size. Most of these associations co-localized with previously known quantitative trait loci (QTLs), validating hence the efficiency of this approach, whereas others correspond to new loci that have not been identified before. New putative associations were also detected for complex traits such as ripening time, cluster architecture or berry shape and firmness. However no associations were detected for other traits such as fertility or flowering time. Although the detection power provided by the SSR-based association analysis was lower than that of SNP-based GWAS, it allowed to detect previously discovered large effect QTLs, and confirmed SNP-based associations found in the present study, but also provided some evidence of new associations. Overall, the present research demonstrates the potential of association mapping in the identification of genetic loci underlying traits of interest in grapevine, highlighting the strengths and weaknesses that need to be taken into consideration in future GWAS projects.