Resumen de Structural-functional analysis of lacto-N-biosidase from Bifidobacterium Bifidum: a potential biocatalyst for the production of human milk oligosaccharides
Els efectes beneficiosos que els oligosacàrids de la llet materna (OLM) confereixen a la salut dels lactants s'ha estudiat durant anys. Aquests oligosacàrids proporcionen una barrera protectora i un suport nutritiu essencials, als quals no tenen accés els nens que no prenen llet materna. La llet humana és considerada única respecte a la resta de llets de mamífers pel que fa a la quantitat i la complexitat d'oligosacàrids. Actualment, s'han identificat més de 130 estructures químiques diferents de OLM, i no es disposa de cap recurs natural que proporcioni accés a aquestes estructures tan complexes i a bastament. De la mateixa manera, la síntesi química és complicada a causa de l'estructura tan complexa i diversa que presenten els OLM, i de moment, la síntesi en gran escala no ha estat possible. La síntesi enzimàtica, en canvi, es presenta com una eina alternativa de síntesi d'aquestes molècules complexes atès que, en la naturalesa els enzims són els responsables de formar enllaços glicosídics entre carbohidrats amb alta regio- i estereoselectivitat. L'objectiu d'aquesta tesi és avaluar l'ús de l'enzim Lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum (LnbB) com un biocatalizador eficient des de dues perspectives diferents: i) l'estudi estructural-funcional de LnbB i ii) la generació de biocatalizadors capaços de sintetitzar l'oligosacàrid d'interès (lacto-N-tetraosa) mitjançant enginyeria de proteïnes en l'enzim LnbB. En aquesta tesi, hem analitzat l'organització dels dominis dels enzims de la família GH20, i, en conseqüència, hem definit dos models d'arquitectures. El Model A conté almenys dos dominis, un domini GH20b no catalític i el GH20 catalític, que sempre es presenta acompanyat d'una ?-hèlix extra. En canvi, el Model B consisteix únicament en el domini catalític GH20. Mitjançant l'expressió de diferents formes truncades de LnbB, hem descrit els requeriments estructurals per a la funcionalitat dels enzims GH20, i en particular per LnbB, per tal d’obtenir la unitat funcional mínima que conservi l'activitat enzimàtica. Respecte a la síntesi de la lacto-N-tetraosa usant com a biocatalizador noves proteïnes de LnbB obtingudes mitjançant enginyeria de proteïnes, hem contemplat dues estratègies enzimàtiques diferents. En primer lloc, l'estratègia de glicosintasa, en la qual l'enzim (amb mutació en el residu assistent) és capaç de transferir el corresponent donador activat (sucre sintètic derivat d’oxazolina) a un acceptor, sense hidròlisi del producte. En segon lloc, l'estratègia de transglicosilació millorada, en la qual, una nova generació de mutants en els llocs d'unió a l'acceptor seran capaços d'acomodar de manera més favorable un sucre en lloc d'una molècula d'aigua, i d'aquesta manera, augmentar l'activitat de transglicosilació.
