Resumen de Novel bioelectrochemical approaches for exploring extracellular electron transfer in "Geobacter sulfurreducens"
- español
Los sistemas electroquímicos microbianos son aquellos en los que los microorganismos actúan, en combinación con electrodos, como catalizadores de reacciones redox. Estos sistemas permiten transformar la energía química en energía eléctrica mediante la acción de ciertos microorganismos (e.g. Geobacter sulfurreducens) que tienen la capacidad de oxidar compuestos orgánicos, acoplando dicha reacción a la reducción de un aceptor de electrones extracelular (e.g. electrodos). La fusión de dos campos tan diferentes como la microbiología y la electroquímica ha dado lugar a una disciplina nueva y versátil que requiere la sinergia de ambos. Esta tesis doctoral se compone de 5 capítulos, 3 de ellos experimentales, que exploran diferentes aspectos de los sistemas electroquímicos microbianos, utilizando como modelo de bacteria electroactiva a G. sulfurreducens. El objetivo principal de la investigación fue desarrollar nuevas estrategias para profundizar en la comprensión del proceso de transferencia de electrones extracelular (TEE), así como para explorar nuevas plataformas ioelectroquímicas. En vista de lo anterior, el Capítulo 1 explora el estado del arte sobre el uso de G. sulfurreducens en sistemas electroquímicos microbianos. Dicha bacteria posee la capacidad de establecer contacto electroquímico con aceptores extracelulares mediante a la presencia de una extensa red de citocromos de tipo c que conecta el citoplasma con el exterior celular. Con el fin de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE se han realizado estudios de deleción génica para intentar obtener células incapaces de producir determinados citocromos tipo c. Sin embargo, las construcciones genética resultantes no mostraron el comportamiento (fenotipo) esperado por lo que, en esta tesis, nos planteamos un enfoque alternativo basado en el metabolismo asimilatorio del hierro y su efecto en la síntesis de grupos hemo. Desde un punto de vista microbiológico los sistemas clásicos que se emplean en el desarrollo de la electroquímica microbiana implican complejos montajes experimentales, largos períodos de acondicionamiento y costes sustanciales. En este sentido, la miniaturización de los dispositivos bioelectroquímicos puede suponer ventajas considerables, tales como respuestas en producción de corriente o la reducción de costes. Estas características serían especialmente deseables en sistemas electroanalíticos. Otro requisito para los sistemas electroquímicos microbianos es la formación de un biofilm bacteriano maduro, lo cual suele implicar largos períodos de tiempo. Este proceso podría simplificarse mediante la construcción artificial de un sistema bacteria-electrodo. De acuerdo con los retos identificados, el Capítulo 1 concluye describiendo los tres objetivos específicos que conforman esta tesis doctoral: i) Investigar el papel de los citocromos de Geobacter en la TEE, ii) Explorar los electrodos serigrafiados como instrumentos miniaturizados para una rápida evaluación electroquímica de microorganismos electroactivos, iii) Construir bioelectrodos artificiales basados en Geobacter Con el objetivo de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE, el Capítulo 2 describe un método para el cultivo de células de G. sulfurreducens carentes de citocromos. Los análisis bioquímicos basados en la tinción específica del grupo hemo, junto a otros basados en espectrometría de masas y en espectroscopía Raman, demostraron que es factible modificar el contenido de citocromos en G. sulfurreducens limitando la disponibilidad de hierro en el medio de cultivo. Las células carentes de citocromos eran viables ya que pudieron reducir fumarato a succinato, una reacción a nivel de la membrana interna que no requiere citocromos, pero no fueron capaces de reducir hierro citrato (III) o de intercambiar electrones con un electrodo. Estos resultados confirmaron que los citocromos de tipo c son esenciales para la TEE en G. sulfurreducens. Teniendo en cuenta la necesidad de simplificar los aspectos electroquímicos, el Capítulo 3 investiga el uso de electrodos serigrafiados (SPEs) como una nueva plataforma de bajo coste para evaluar la actividad electroquímica microbiana a un nivel de microescala. Los SPEs resultaron ser válidos para identificar respuestas bioelectroquímicas, evitando complejos montajes. El sistema se validó mediante el estudio de la respuesta de G. sulfurreducens bajo diversos estados fisiológicos. Además, el uso de SPE y G. sulfurreducens reveló su potencial como biosensor para la cuantificación de acetato y para explorar muestras de naturaleza tan compleja como las aguas residuales urbanas. La identificación de consorcios electroactivos resultó ser otra de las aplicaciones de esta tecnología. Como aporte científico final, el Capítulo 4 explora una nueva estrategia para utilizar G. sulfurreducens en la de construcción bioelectrodos artificiales, mediante la inmovilización de las células en gel de sílice sobre electrodos de fieltro de carbono. El análisis de viabilidad confirmó que la mayoría de las células sobrevivieron al proceso de encapsulación y que la densidad celular no evolucionó, al menos, durante un período de 96 h. Esta doble encapsulación impide la liberación de bacterias del electrodo, pero permite la difusión de solutos, haciendo posible la caracterización electroquímica del sistema. Los bioelectrodos artificiales se evaluaron en sistemas de 3 electrodos durante varios días utilizando diversos donadores de electrones. El análisis voltamétrico de los bioelectrodos alimentados con acetato mostró una onda de oxidación catalítica sigmoidal desde el inicio, característica de biofilms más maduros. Además, se confirmó la presencia de G. sulfurreducens dentro de las fibras y del gel de sílice por microscopía electrónica de barrido y también se realizó un análisis transcriptómico para estudiar el efecto de la encapsulación a nivel intracelular. A partir de los resultados obtenidos, el Capítulo 5 presenta una discusión general, conclusiones y perspectivas de futuro. Este capítulo fue concebido con una estructura de preguntas y respuestas que confío ayude al lector a entender las razones que sustentaron tanto nuestra experimentación como la interpretación que hicimos de la misma. El valor fundamental de este trabajo es la naturaleza sencilla, rápida y económica de las herramientas proporcionadas que pueden ayudar a otros investigadores en el campo de la electroquímica microbiana.
- English
Microbial electrochemical systems deal with electrochemical systems in which living cells like electroactive microorganisms serve as catalysts for either oxidation or reduction reactions. These devices enable to transform chemical energy into electricity by the action of some bacteria (e.g. Geobacter sulfurreducens) that are able to oxidize organic compounds coupled to the reduction of an extracellular electron acceptor (e.g. electrode). The merging of two fields as different as microbiology and electrochemistry have resulted in a very powerful and versatile discipline that requires the synergy of both.
This PhD thesis consists of 5 chapters, 3 of them experimental, that explore different aspects of microbial electrochemical systems, based on the model electroactive bacteria G. sulfurreducens. The research aims to develop novel approaches for further understanding Extracellular Electron Transfer (EET) process as well as for providing cutting-edge bioelectrochemical platforms.
In view of the foregoing, Chapter 1 provides a literature review and contextualization of the use of G. sulfurreducens in microbial electrochemical systems. The mechanisms that allow G. sulfurreducens to establish redox contact with extracellular acceptors are based on the presence of a vast network of c-type cytochromes that facilitates electron transport from central metabolism. In order to verify the role of c-type cytochromes in EET, some deletion studies have attempted to obtain entirely EET-free cells. Nonetheless, knock-out cells did not display the expected phenotype, therefore we plan to follow an alternative approach as one of task of this thesis.
From a microbiology point of view, classical systems used in Microbial Electrochemical Technologies (METs) involve complex experimental setups, long conditioning periods, and substantial costs. So thus, miniaturization of bioelectrochemical devices may bring considerable advantages, such as rapid electrical responses or cost reduction. These features would be especially desirable in systems with a potential use in electroanalysis.
Another requirement for microbial electrochemical systems is the formation of a mature microbial biofilm. However, the long process needed for its development could be overcome by artificially assembling a bacteriaelectrode system (bioelectrode). Ready-to-use artificial bioelectrodes may represent a versatile time and cost saving strategy for microbial electrochemical technologies. They could be customized in terms of size, bacterial concentration or conductive support materials, among others aspects.
According to the identified challenges, Chapter 1 ends describing the three main research goals of this thesis:
i) investigating the role of Geobacter´s cytochromes in EET, ii) exploring SPEs as miniaturized tools for rapid assessing microbial electrochemistry, and iii) constructing ready-to-use Geobacter-based artificial bioelectrodes.
Chapter 2 shows a straightforward method for growing cytochromedepleted cells of G. sulfurreducens with the aim to confirm the role of c-type cytochromes in EET. Heme-staining based protocols together with other tecniques like inductively coupled plasma mass spectrometry, and in situ nanoparticle enhanced raman spectroscopy analysis, revealed that the cytochrome content could be severely decreased by limiting iron availability in growth media. The cytochrome-depleted cells were viable since they could reduced fumarate to succinate at inner-membrane level using a cytochrome-free reaction. However, cytochrome-free cells were unable to reduce Fe (III) citrate or to exchange electrons with a graphite electrode. These results confirm that c-type cytochromes are essential for extracellular electron transfer in G. sulfurreducens.
Simplifying the electrochemical aspects for culturing electroactive bacteria is a must in this new discipline. So thus, Chapter 3 investigates the use of Screen-Printed Electrodes (SPEs) as a novel low-cost platform for assessing microbial electrochemical activity at the microscale level. SPEs proved to be robust for identifying the bioelectrochemical response, while avoiding complex electrochemical set-ups. The system was successfully validated for characterizing the response of G. sulfurreducens under diverse physiological states revealing different electron transfer responses. Moreover, a combination of SPE and G. sulfurreducens resulted to be a promising biosensor for quantifying the levels of acetate and for using samples as complex as urban wastewater. In addition, the potential of the technology for identifying electroactive consortia was also successfully tested.
As a final scientific contribution, Chapter 4 explores a new strategy for constructing ready-to-use artificial bioelectrodes of G. sulfurreducens by means of effective immobilization of cells inside silica gel and carbon felt electrodes. Viability test confirmed that the vast majority of bacteria survived the encapsulation process and cell density did not change, at least, for a 96 h period. This double entrapment prevents bacterial release from the electrode but allows solute diffusion, making possible the electrochemical characterization of the system. Artificial bioelectrodes were evaluated in 3- electrodes reactors for several days, using several electron donors. Cyclic voltammetry of acetate-fed bioelectrodes revealed a sigmoidal catalytic oxidation wave from the very beginning, typical of more aged biofilms. Furthermore, the presence of G. sulfurreducens within the fibers and silica gel could be verified by scanning electron microscopy and the transcriptomic response of cells encapsulated was analyzed as well.
Based on our results, a general discussion, conclusions and future outlook are presented in Chapter 5. This chapter was structured in a question-answer mode. We believe this format could help the reader to understand the reasons beyond the experimental activities together with those supporting the research interpretation. The main value of this work is the straightforward, fast and economical nature of the tools provided that can help other researchers in microbial electrochemistry field
