Development of "Streptomyces rimosus" expression system for production of heterologous proteins
- Autores: Andrés Felipe Carrillo Rincón
- Directores de la Tesis: Hrvoje Petkovic (dir. tes.), Gabriel Moncalián Montes (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2017
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 141
- Títulos paralelos:
- Desarrollo de un sistema de expresión de proteínas heterólogas basado en "Streptomyces rimosus"
- Tribunal Calificador de la Tesis: Natasa Poklar (presid.), Matxalen Llosa Blas (secret.), Andriy Luzhetskyy (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad de Cantabria
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: UCrea
- Resumen
- español
La presente tesis contiene dos capítulos. El primer capítulo se centra en el estudio del dominio aciltransferasa del cuarto modulo involucrado en la biosíntesis del policétido conocido como tacrolimus, fármaco empleado como agente inmunosupresor. La importancia de esta aciltransferasa radica en su capacidad para seleccionar unidades extensoras poco usuales en la biosíntesis de policétidos, pero al mismo tiempo rechaza las unidades extensoras comunes empleadas en la biosíntesis de estos productos naturales. Por tanto, el entendimiento de esta aciltransferasa podría facilitar la incorporación de unidades extensoras poco usuales a diferentes policétidos. De este modo incrementado la diversidad estructural de estos importantes productos naturales. Para la obtención del dominio aciltransferasa del cuarto modulo (fkAT4) de tacrolimus se emplearon los sistemas de expresión de proteínas basados en los microorganismos Escherichia coli y Pichia pastoris. Los resultados demostraron que P. pastoris no es capaz de producir el dominio fkAT4, mientras que de E. coli solo se pudieron obtener agregados insolubles del domino fkAT4 los cuales no demostraron actividad enzimática luego de ser replegados. Dado los resultados obtenidos con los dos sistemas de expresión empleados se hace necesario el desarrollo de un sistema de expresión de proteínas basado en un microorganismo capaz de expresar proteínas que E. coli o P. pastoris no puedan expresar. El segundo capítulo describe el desarrollo del kit genético específico para utilizar el microorganismo Streptomyces rimosus en la producción de proteínas heterólogas. El kit incluye una serie de plásmidos y promotores que permitieron usar a S. rimosus como huésped para la producción extracelular de fitasa. La fitasa es una enzima usada industrialmente como aditivo para la alimentación porcina. Dado la complejidad estructural de la fitasa, E. coli tiende a producir cuerpos de inclusión de fitasa, mientras que P. pastoris glicosila la enzima. Por tanto, esta enzima representa un buen ejemplo para demostrar las capacidades de S. rimosus en la producción de proteínas complejas. El kit genético diseñado para S. rimosus permitió demostrar que este microorganismo es capaz de producir y exportar la fitasa al medio extracelular, de este modo facilitando la purificación de la enzima mediante cromatografía de afinidad usando directamente el sobrenadante y de este modo evitando tener que romper el contenido celular. Además, mediante el transcriptoma de S. rimosus se pudieron establecer los diferentes mecanismos por los cuales este huésped secreta las proteínas al medio extracelular. El sistema desarrollado en esta tesis para la producción de proteínas heterólogas basado en S. rimosus ofrece una alternativa real a los sistemas de expresión de proteínas actuales.
- English
This thesis compromises two chapters. The first chapter describes a number of efforts to express and purify the acyltransferase of module 4 (fkAT4) involved in the biosynthesis of the medically important compound tacrolimus. Such efforts were attempted using E. coli and P. pastoris expression systems. Although it was possible to obtain the fkAT4 domain refolding inclusion bodies formed by E. coli, the recombinant domain purified didn’t keep the correct folding pattern, and thus in-vitro assays couldn’t be accomplished. The second chapter describes the development of Streptomyces rimosus platform as an alternative expression system for production of extracellular heterologous proteins. Results demonstrated the capacity of Streptomyces rimosus to produce phytase extracellularly, thus facilitating downstream processing. In addition, throughout a comparative analysis of S. rimosus transcriptome, the genetic information related for protein production, such as the secretion pathways (Sec and Tat) and production of endogenous proteases which can degrade the target protein, are described. Information gathered form the transcriptome enhanced the understanding of S. rimosus genetics, this way facilitating further efforts to develop the chassis of S. rimosus specific for production of heterologous proteins.
- español
