Resumen de Aplicaciones clínicas de la determinación de ADN circulante.
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA DETERMINACION DE ADN CIRCULANTE Autora: Hada Macher Manzano Directores: Juan Miguel Guerrero Montavez y Amalia Rubio Calvo.
El ADN circulante es actualmente una potente herramienta diagnóstica, pronóstica y con posibilidad de aplicación en la monitorización de respuesta al tratamiento en diversas enfermedades y patologías. Así mismo el ADN circulante del feto en el plasma materno se utiliza como técnica de diagnóstico prenatal no invasivo del RHD fetal en la gestante RhD negativa desde el año 2000 en Inglaterra y se ha ido instaurando progresivamente hasta nuestros días en todos los hospitales importantes de Europa. Hemos centrado esta tesis en las técnicas que más trascendencia podrían tener por su aplicación clínica para el Hospital Virgen del Rocío, proponiéndose los siguientes objetivos: 1.- Valorar la estabilidad del ADN en suero a 4ºC antes de su congelación con el objeto de validar el circuito establecido para la recogida y procesamiento de las muestras provenientes de pacientes ingresados en UCI. Se concluye que la cantidad de ADN en suero se mantiene estable durante las primeras 24 h a 4ºC antes de ser alicuotado y congelado, lo que valida nuestro circuito de recogida de muestras en el laboratorio de urgencias.
2.- Hacer un estudio cuantitativo del ADN circulante en pacientes que sufren traumatismo craneoencefálico en el momento del ingreso y como criterio de evolución durante cinco días. Se concluye que la cuantificación del ADN circulante es una variable objetiva que está correlacionada directamente con la severidad del daño en un paciente que sufre traumatismo craneoencefálico grave.
3.- Poner a punto la técnica de diagnóstico del RHD fetal en el plasma materno de gestantes RhD negativas y optimizar la técnica por PCR multiplex sin perder exactitud de resultados. Se consigue el diagnóstico del RHD fetal en plasma materno con un 100% de sensibilidad y una exactitud del 99.3%, aplicando una técnica de PCR multiplex, capaz de diagnosticar el sexo fetal y el RHD en un solo paso, ahorrando tiempo, reduciendo costos y abriendo la posibilidad de la automatización de todo el proceso.
4.- Se propone diagnosticar la mutación puntual de pacientes con MEN2A, heredada con carácter autosómico dominante, en ADN circulante mediante HRM en vez de por secuenciación. Concluyendo que el diagnóstico de la mutación puntual C634Y en el oncogén c-RET de los pacientes que sufren el síndrome MEN2A se puede realizar de una manera fiable mediante el análisis del ADN circulante en suero por HRM. Este análisis es además un método diagnóstico tan seguro como la secuenciación para los estudios familiares de la mutación descrita, siendo mucho más rápido, de menor costo, y con una menor manipulación de las muestras.
5.- Se propone un diagnóstico prenatal no invasivo de la mutación puntual heredada del padre en el ADN fetal circulante en el suero de la gestante sana portadora de feto que padece MEN2A. Se consigue mediante COLD PCR HRM, ofertando un diagnóstico de sospecha razonable que justifica proponer técnicas diagnósticas de confirmación de manera precoz aunque sean invasivas.
6.- Se hace un análisis cuantitativo del ADN circulante en pacientes que padecen MEN2A como herramienta analítica del seguimiento de su enfermedad, estableciendose una relación directa entre la cantidad de fragmentos pequeños (106 pb) de ADN circulante y la actividad de su enfermedad.
Como consecuencia de este trabajo se han publicado los siguientes artículos científicos: 1. Macher HC, Noguerol P, Medrano-Campillo P, Garrido-Márquez MR, Rubio-Calvo A, Carmona-González M, Martin-Sánchez J, Pérez-Simón JA, Guerrero JM (2012) Standardization non-invasive fetal RHD and SRY determination into clinical routine using a new multiplex RT-PCR assay for fetal cell-free DNA in pregnant women plasma: Results in clinical benefits and cost saving. Clin Chim Acta 413:490-494 2. Macher HC, Egea-Guerrero JJ, Revuelto-Rey J, Gordillo-Escobar E, Enamorado-Enamorado J, Boza A, Rodriguez A, Molinero P, Guerrero JM, Dominguez-Roldán JM, Murillo-Cabezas F, Rubio A (2012) Role of early cell-free DNA levels decrease as a predictive marker of fatal outcome after severe traumatic brain injury. Clin Chim Acta 414:12-17.
3. Macher HC, Martinez-Broca MA, Rubio-Calvo A, León-García C, Conde-Sánchez M, Costa A, Navarro E, Guerrero JM (2012) Non-invasive Prenatal Diagnosis of Multiple Endocrine Neoplasia Type 2A using COLD-PCR Combined with HRM Genotyping Analysis from Maternal Serum. PLOS One (enviado tras segunda revisión).
