Study of the mechanisms of iron homeostasis in the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis
- Autores: Elisabeth Maria Tamayo Martinez
- Directores de la Tesis: Nuria Ferrol (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2017
- Idioma: inglés
- ISBN: 9788491635246
- Número de páginas: 274
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Asunción Morte Gómez (presid.), José Antonio Herrera Cervera (secret.), Sergi Puig Todolí (voc.), Natalia Requena (voc.), M. Jose Pozo Jiménez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Biología Fundamental y de Sistemas
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
Las simbiosis micorrícico arbusculares (MA) que implican a la mayoría de las plantas y los hongos Glomeromycota (MA) son partes integrales y funcionales de las raíces de las plantas. En estas asociaciones, el hongo no sólo coloniza la corteza de la raíz, sino que también mantiene una red extensa de hifas que se extienden fuera de la raíz en el entorno circundante. Estas hifas externas contribuyen a la absorción vegetal de nutrientes de baja movilidad, como P, Fe y Zn. Además de mejorar la nutrición mineral de la planta, los hongos MA alivian de la toxicidad de metales pesados a las plantas hospedadoras. El metal pesado Fe desempeña un papel esencial en muchos procesos biológicos, pero es tóxico cuando está presente en exceso, ya que puede producir radicales libres a través de la reacción de Fenton. Por ello, es de particular importancia el control de su transporte y homeostasis en todos los organismos vivientes. Los hongos MA tienen un papel importante en la modulación de la adquisición de metales pesados por la planta en un amplio rango de concentración del metal en el suelo y se han considerado un elemento clave en la mejora de las concentraciones de micronutrientes de los cultivos y en la fitorremediación de suelos contaminados. Aunque el principal beneficio de la asociación MA es una mejora en el estado del P de la planta micorrizada, los hongos MA también desempeñan una función en la nutrición de Fe de la planta hospedadora, y se han encontrado evidencias directas de la capacidad del micelio extrarradical (ERM, en inglés extraradical mycelium) para absorber Fe del suelo y transferirlo a la planta hospedadora. Por el contrario, otros estudios han demostrado que los hongos MA desempeñan un papel reduciendo la absorción de Fe cuando la concentración en el suelo es alta. Sin embargo, se sabe poco acerca de los mecanismos de absorción y homeostasis de Fe en micorrizas arbusculares.
En esta tesis doctoral se han utilizado varios métodos para analizar los mecanismos de homeostasis de Fe en el hongo MA modelo Rhizophagus irregularis, fácilmente cultivable en cultivos monoxénicos y cuyo genoma se ha secuenciado recientemente. Se han realizado análisis a genoma completo con el objeto de identificar genes de R. irregularis implicados en el transporte y homeostasis de Fe, haciendo uso de bases de datos de transporte, sitios web de genomas de organismos y herramientas bioinformáticas in silico para análisis de secuencias, como software para predicciones de estructura proteica y métodos para análisis filogenéticos. Para los estudios experimentales, se establecieron cultivos monoxénicos de R. irregularis con fin de obtener material exclusivamente fúngico para el subsecuente aislamiento génico, análisis de expresión génica o ensayos enzimáticos. Dado que no es posible manipular genéticamente los hongos MA, los análisis funcionales y de localización de los genes recién identificados de R. irregularis se llevaron a cabo en un sistema heterólogo: la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae.
Como un primer enfoque para entender los mecanismos de homeostasis de Fe, se realizó un análisis a genoma completo de transportadores de Fe. Este análisis in silico permitió la identificación de 12 marcos abiertos de lectura en el genoma de R. irregularis, que codifican potencialmente transportadores de Fe implicados en la adquisición de hierro desde el suelo o en su uso y almacenamiento en diferentes compartimentos celulares. La comparación filogenética con los genomas de un grupo de hongos de referencia mostró una expansión de algunas familias de transportadores de Fe. El análisis de los perfiles transcriptómicos publicados de R. irregularis reveló que algunos genes se regularon al alza en raíces micorrizadas comparados con esporas germinadas y ERM, lo que sugirió que el Fe es un metal importante para la colonización de la planta. Dentro del complemento completo de genes que codifican transportadores de Fe identificados en el genoma de R. irregularis se encontraron dos componentes de una vía reductiva de transporte de Fe de alta afinidad, RiFTR1 y RiFTR2, que mostraron una alta homología con la permeasa de Fe Ftr1 de S. cerevisiae.
En el sistema bien caracterizado de S. cerevisiae, el primer paso del sistema reductivo de asimilación de Fe se realiza por las metalorreductasas Fre1 y Fre2. A continuación, el Fe reducido es absorbido rápidamente por un complejo de transporte de alta afinidad específico de hierro ferroso que consiste en una ferroxidasa multicobre de membrana plasmática (Fet3) que oxida el Fe, el cual es entonces transportado al citosol por una permeasa (Ftr1). Cuando se examinó in vivo la actividad reductasa férrica sobre el micelio de R. irregularis, se encontró un nivel basal de actividad en el micelio crecido en placas control, que fue activada cuando el micelio se cultivó en medio sin Fe. Estos datos indicaron que el sistema reductivo de absorción de Fe está funcionando en R. irregularis. Sólo se encontró un homólogo de reductasa férrica, RiFRE1, en el genoma de R. irregularis, pero no fue capaz de restaurar el pobre crecimiento del mutante de levadura fre1-2 en condiciones de deficiencia de Fe, probablemente debido a la baja homología de secuencia de RiFRE1 y ScFRE1-2. La caracterización proteica y los análisis de expresión génica de los otros dos componentes putativos de la vía reductiva de adquisición de Fe en R. irregularis, RiFTR1 y RiFTR2, indicaron que RiFTR1 juega un papel in vivo en la adquisición reductiva de Fe de alta afinidad en ambientes limitantes de Fe. Sin embargo, el papel de RiFTR2 en R. irregularis no se ha podido dilucidar en nuestro estudio, probablemente debido a que la proteína no pudo salir del retículo endoplasmático, como se mostró en los ensayos de localización en levadura. También se encontró que los genes que codifican los tres componentes de la vía reductiva de asimilación de Fe identificados (RiFRE1, RiFTR1 y RiFTR2) son genes de respuesta a Fe, como se mostró con los análisis de expresión génica realizados por RT-PCR a tiempo real.
Con el fin de identificar el compañero ferroxidasa de RiFTR1, se realizó una búsqueda de genes candidatos pertenecientes a la familia de oxidasas multicobre (MCOs, del inglés multicopper oxidases). Con este estudio se concluyó que R. irregularis tiene al menos nueve MCOs (RiMCO1-9) en el genoma. Los análisis de intrones y de similitud definieron cinco subfamilias génicas. Sin embargo, un análisis filogenético de secuencias MCO de diferentes grupos taxonómicos reveló que todas las RiMCOs pertenecen al grupo de ferroxidasas/lacasas, y ninguna se agrupó con las ferroxidasas tipo Fet3. RiMCO1 fue el único gen de MCO que mostró un patrón de expresión génica típico de un componente del transporte de Fe de alta afinidad. Además, RiMCO1 permite que el mutante fet3 de levadura absorba Fe. Estos datos sugieren que RiMCO1 podría tener un papel en el sistema reductivo de absorción de Fe de alta afinidad junto con el transportador de Fe RiFTR1 en el ERM. Sin embargo, algún(os) otro(s) miembro(s) de la familia RiMCO también podría(n) tener actividad ferroxidasa. Los análisis de expresión génica también revelaron que algunos transcritos fueron muy abundantes en el ERM (RiMCO1 y RiMCO5) y otros en el micelio intrarradical (RiMCO2), lo que sugiere que las diferentes RiMCOs tienen funciones específicas.
Finalmente, para intentar identificar algunos otros elementos implicados en la regulación de la homeostasis de Fe en R. irregularis, y dado que se ha demostrado que las glutarredoxinas (GRXs) Grx3-4 y Grx5 de levadura tienen un papel en la homeostasis de Fe, se identificó y caracterizó el complemento completo de GRXs en R. irregularis (RiGRX1,4,5,6) (RiGRX1 se caracterizó previamente en nuestro grupo). Los análisis funcionales en el sistema heterólogo mostraron que mientras que las cuatro GRXs de R. irregularis están implicadas en la protección frente a estrés oxidativo, RiGRX4 y RiGRX5 (homólogas a ScGrx3-4 y ScGrx5, respectivamente) también tienen un papel en la homeostasis de Fe en levadura. Además, los datos de expresión génica mostraron que RiGRX4 fue el único gen de glutarredoxina de respuesta a Fe, lo que sugirió que podría estar implicado en la regulación de la absorción de Fe mediante la interacción con factores de transcripción de respuesta a hierro, como se ha demostrado anteriormente para sus homólogos en otros hongos. El aumento de la expresión de RiGRX1 y RiGRX6 en el micelio intrarradical sugiere que estas GRXs podrían tener un papel clave en la protección frente a estrés oxidativo de R. irregularis durante su fase in planta.
A pesar de que en esta tesis doctoral sólo se han caracterizado los transportadores del hongo implicados en la absorción de hierro del suelo y las glutarredoxinas, se propone un modelo integrador para la regulación de la homeostasis de hierro y su transporte a través de la vía micorrícica en una raíz micorrizada.
- English
Arbuscular mycorrhizal (AM) symbioses that involve most plants and Glomeromycota (AM) fungi are integral and functional parts of plant roots. In these associations, the fungi not only colonize the root cortex but also maintain an extensive network of hyphae that extend out of the root into the surrounding environment. These external hyphae contribute to plant uptake of low mobility nutrients, such as P, Fe and Zn. Besides improving plant mineral nutrition, AM fungi can alleviate heavy metal (HM) toxicity to their host plants. The HM Fe plays essential roles in many biological processes but is toxic when present in excess, since it can produce toxic free radicals via the Fenton reaction. This makes its transport and homeostatic control of particular importance to all living organisms. AM fungi play an important role in modulating plant HM acquisition in a wide range of soil metal concentrations and have been considered to be a key element in the improvement of micronutrient concentrations in crops and in the phytoremediation of polluted soils. Although the main benefit of the AM association is an improved P status of the mycorrhizal plant, AM fungi also play a role in Fe nutrition of their host plants, and direct evidence of the capability of the extraradical mycelium (ERM) to take up Fe from the soil and to transfer it to the host plant has been found. Conversely, other studies have shown that AM fungi play a role in reducing Fe uptake when the soil concentration is high. Nevertheless, little is known about the mechanisms of Fe uptake and homeostasis in arbuscular mycorrhizas.
Within this PhD thesis, several methods have been used to analyze the mechanisms of Fe homeostasis in the model AM fungus Rhizophagus irregularis, which is easily grown in monoxenic cultures and whose genome has been recently sequenced. Genome-wide analyses were undertaken in order to identify R. irregularis genes involved in Fe transport and homeostasis, by making use of transport databases, genome organism websites and in silico bioinformatics tools for sequence analyses, such as software for protein structure predictions and methods for phylogenetic analyses. For experimental studies, R. irregularis monoxenic cultures were established in order to obtain exclusively fungal material for the subsequent gene isolation, gene expression analyses or enzymatic assays. Since it is not still possible to genetically manipulate AM fungi, functional and localization analyses of the newly identified R. irregularis genes were performed in a heterologous system: the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.
As a first approach to get some insights into Fe homeostasis mechanisms, a genome-wide analysis of Fe transporters was performed. This in silico analysis allowed the identification of 12 open reading frames in the R. irregularis genome, which potentially encode Fe transporters involved in iron acquisition from the soil or iron use and storage in the different subcellular compartments. Phylogenetic comparisons with the genomes of a set of reference fungi showed an expansion of some Fe transporter families. Analysis of the published transcriptomic profiles of R. irregularis revealed that some genes were up-regulated in mycorrhizal roots compared to germinated spores and ERM, which suggests that Fe is a metal important for plant colonization. Two components of a reductive pathway of high-affinity Fe transport, RiFTR1 and RiFTR2, were found to be within the full complement of genes encoding Fe transporters identified in the R. irregularis genome, showing high homology to the S. cerevisiae Fe permease Ftr1.
In the well characterized S. cerevisiae system, the first step of the reductive Fe assimilation system is accomplished by the metalloreductases Fre1 and Fre2. Then, the reduced ferrous Fe is rapidly taken up by a high-affinity ferrous-specific transport complex consisting of a plasma membrane multicopper ferroxidase (Fet3) that oxidizes the Fe, which is then transported to the cytosol by a permease (Ftr1). When the ferric reductase activity was assayed in vivo on R. irregularis mycelia, it was found a basal level of activity in mycelium grown in control plates, which was activated when mycelia was grown in media without Fe. These data indicated that the reductive Fe uptake system is operating in R. irregularis. Only one ferric reductase homolog, RiFRE1, was found in the R. irregularis genome, but it was not able to restore the poor growth of the fre1-2 yeast mutant under low-Fe conditions, probably due to the low sequence homology of RiFRE1 and ScFRE1-2. Protein characterization and gene expression analyses of the two other putative components of the reductive pathway of Fe acquisition in R. irregularis, RiFTR1 and RiFTR2, indicated that RiFTR1 plays an in vivo role in high-affinity reductive Fe acquisition in Fe-limited environments. Nevertheless, the role of RiFTR2 in R. irregularis has not been elucidated in our study, probably because the protein failed to exit the ER, as shown in the yeast localization assays. It was also found that the genes encoding the three components of the reductive Fe assimilation pathway identified (RiFRE1, RiFTR1 and RiFTR2) are responsive to Fe, as shown by the gene expression analyses performed by real time RT-PCR.
In order to identify the ferroxidase partner of RiFTR1, a search for candidate genes belonging to the multicopper oxidase (MCO) family was performed. It was concluded that R. irregularis has at least nine MCOs (RiMCO1-9) in its genome. Intron and similarity analyses defined five gene subfamilies. However, a phylogenetic analysis of MCO sequences of different taxonomic groups revealed that all the RiMCOs belong to the ferroxidase/laccase group and none of them clustered with the Fet3-type ferroxidases. RiMCO1 was the only MCO displaying a gene expression pattern typical of a high-affinity Fe transport component. Furthermore, RiMCO1 enables the fet3 yeast mutant to take up Fe. These data suggest that RiMCO1 might have a role in the reductive high-affinity Fe uptake system together with the Fe transporter RiFTR1 at the ERM. However, some other member(s) of the RiMCO family could also have ferroxidase activity. Gene expression analyses also revealed that some transcripts were very abundant in the ERM (RiMCO1 and RiMCO5) and others in the intraradical mycelium (RiMCO2), suggesting the different RiMCOs have specific functions.
Finally, as an attempt to identify some other elements involved in the regulation of Fe homeostasis in R. irregularis, and since the yeast glutaredoxins (GRXs) Grx3-4 and Grx5 have been shown to have a role in Fe homeostasis, the full complement of GRXs in R. irregularis (RiGRX1,4,5,6) was identified and characterized (RiGRX1 was previously characterized in our group). Heterologous functional analyses showed that while the four R. irregularis GRXs are involved in oxidative stress protection, RiGRX4 and RiGRX5 (homologues of ScGrx3-4 and ScGrx5, respectively) also play a role in Fe homeostasis in yeast. In addition, gene expression data showed that RiGRX4 was the only R. irregularis GRX gene responsive to Fe, suggesting that it might be involved in Fe uptake regulation by interacting with iron-responsive transcription factors, as previously shown for its homologs in other fungi. Increased expression of RiGRX1 and RiGRX6 in the intraradical mycelium suggests that these GRXs could play a key role in oxidative stress protection of R. irregularis during its in planta phase.
Despite in this PhD thesis only the fungal transporters involved in iron uptake from the soil and the glutaredoxins have been characterized, an integrating model is proposed for regulation of iron homeostasis and transport through the mycorrhizal pathway in a mycorrhizal root.
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