Resumen de Cultivo y utilización de microorganismos fotosintéticos psicrófilos obtenidos de Laguna de La Caldera en parque nacional de Sierra Nevada para su potencial utilización en biotecnología
“Cultivo y Utilización de Microorganismos Fotosintéticos Psicrófilos Obtenidos de Laguna de La Caldera en Parque Nacional de Sierra Nevada para su Potencial Utilización en Biotecnología” (Resumen) Directores: Dr. Jesús González López Dra. M.J. Belén Juárez Jiménez Departamento de microbiología. Facultad de Farmacia. Instituto de investigación del Agua.
Universidad de Granada Programa de doctorado en Biología Fundamental y de Sistemas Introducción Se han descrito numerosas microalgas en las matrices acuáticas del Parque Natural de Sierra Nevada (Tabla 7). Así, en la laguna de La Caldera se han llevado a cabo numerosos estudios sobre la diversidad microalgal, entre ellos los realizados por Martínez-Silvestre en 1977 identificando especies tales como Scenedesmus ecornis y Tetraedron minimu; esta última especie también ha sido estudiada por Sánchez-Castillo en 1986, identificando, además otras especies de microalgas tales como Oocystis lacustris y Scotiella tuberculata (Sánchez Castillo et al., 1986), Desmodesmus armatus (Sánchez Castillo, 1988), Desmodesmus abundans, Oscillatoria planctónica, Nitzschia hantzschiana y Scenedesmus quadrispina (Sánchez Castillo et al., 1989).
Actualmente la utilización de microalgas como fuente de lípidos para la producción de biocombustibles se presenta como una alternativa bastante fiable y rentable, aunque aún existen limitaciones: a) lograr una productividad de biomasa microalgal con el mayor contenido de lípidos posible, b) diseños de reactores con el fin de lograr mayores rendimientos de biomasa microalgal a costos de instalación y operación competitivos respecto a las formas convencionales de obtención de lípidos, c) diseñar nuevos procesos de cosecha y recolección de biomasa generada por los cultivos. El interés biotecnológico radica en que cuando estos microorganismos fotosinteticos se someten a condiciones de estrés impuestas por estímulos ambientales químicos y físicos, ya sea por separado o en combinación, se promueve la síntesis y acumulación de triglicéridos, seguido también de significativas alteraciones en la composición de los lípidos y ácidos grasos, proteínas y contenido de pigmentos (Gim et al., 2016) En este proyecto en primer lugar se determinó que medio de cultivo reunía las condiciones necesarias para el crecimiento de microoganismos fotosintéticos psicrofilos, para ello se realizaron ensayos con 3 medios de cultivo, RL, GL y RLMo, este ultimo diseñado por nosotros fusionando nutrientes de los medios de cultivo RLy GL. Se utilizó como cepa control del ensayo a 10±2ºC, la microalga"SX1" aislada de las aguas de lavado de las aceitunas recolectadas de la Almazara Nuestra Señora del Perpetuo Socorro, Puente Genil, Córdoba (Andrade et al., 2014). Esta microalga presentó una similitud filogenética de un 99% con Chrorella vulgaris, según la Base de Datos National Center for Biotechnology Information y como cepa control del ensayo realizado a 20±2ºC se utilizó la microalga Scenedesmus obliquus CCAP 276/3A suministrada por el Centro de Investigación Culture Collection of Algae and Protozoa, Oban (Reino Unido).
Resultados y discusión Tras los ensayos realizados a 10º C y 20ºC con los tres medios de cultivo mencionados, se pudo comprobar que la microalga S. obliquus pudo crecer y desarrollarse en todos los medios de cultivo ensayados y a todas las diluciones ensayadas, Esta microalga presento a 10ºC un máximo 480,02±13,11 mg*L-1 con el medio RLMo sin dilución y a 20ºC un máximo de biomasa de 769,83±14,36 mg*L-1 con el mismo medio de cultivo. Por otro lado, la microalga SX1 también fue capaz de proliferar y desarrollarse en los 3 medios de cultivo ensayados, llegando a producir hasta 656,15±30,19mg*L-1 a 20ºC y de 603,31±17,87 mg*L-1a 10ºC ambos con el medio RLMo, sin embargo con el medio GL, se obtuvieron los valores de producción de biomasa más bajos (144,59±5,73 y 163,80±8,78) a 10ºC y 20ºC, respectivamente cuando se ensayó al 20% de sus nutrientes. Tanto a 10º C como a 20ºC con los tres medios de cultivo (RL, GL y RLMo), tanto diluidos y sin diluir, la mayor producción de biomasa se obtuvo con la microalga Scenedesmus O. cuando se cultivó a 20ºC con el medio RL y RLMo. Por otro lado, cuando se cultivó la microalga SX1 la mayor producción de biomasa se obtuvo cuando se utilizó el medio RLMo al 50% de dilución a 20ºC. Con ambas microalgas ensayadas, los peores resultados de producción de biomasa se obtuvieron con el medio GL tanto a 10ºC como a 20ºC con sus respectivas diluciones. Esta diferencia podría deberse a que si bien los medios de cultivos ensayados presentan en su composición disponibilidad de nitrógeno y fósforo como nutrientes principales, el medio RL y RLMo contienen nitrógeno en la forma de KNO3 y NH¬4Cl utilizado habitualmente como referencia de fuente de nitrógeno para algunas microalgas, mientras que el medio GL contiene nitrógeno en la forma de NaNO3. Talukdar et al. 2012, demostraron que algunas microalgas tienen ciertas afinidades al momento de asimilar nitrógeno y esta varía dependiendo del grado de oxidación y/o potencial ionico.
Una vez que se determinó que medio y cuales eran las condiciones relativamente óptimas para el cultivo de microalgas psicrofilas provenientes de la Laguna de la Caldera, se demostró que el medio RLMo, presentaba las mejores condiciones de cultivo para microalgas psicrófilas, de acuerdo a los resultados de biomasa obtenidos en el cultivo de las microalgas control, se llevó a cabo la Metodología de Superficie de respuesta (RSM) por medio del programa estadístico Desing-Expert v8.0.7.1. con el objetivo de obtener una ecuación matemática, que avale y prediga estadísticamente la utilización del medio RLMo y su posible uso en biotecnología, obteniéndose una ecuación de segundo grado, donde se comprobó estadísticamente no solo, cuales eran las hipotéticas condiciones de cultivo para microalgas psicrófilas, sino que las mejores condiciones para obtener el máximo de biomasa microalgal.
En los muestreos realizados en la laguna de La Caldera a lo largo de los 3 años estudiados tanto a finales como a comienzos del verano (Mayo- Junio) y a fines del verano (Agosto- Septiembre) se logró aislar 27 microalgas cultivables. La gran mayoría de las microalgas encontradas están relacionadas con los filos Clorofita y Ocrofitas. Tanto a inicio como finales de verano del filo de las clorofitas agruparon a 17 microalgas aisladas cultivables y 10 de ellas, relacionadas con el filo de las ocrofitas. A inicios del verano dentro de las clorofitas, se encontraron 3 microalgas cultivables relacionadas con la clase Trebouxiophyceae (S3, S4 y S15) y 4 relacionadas con la clase Chlorophyceae ( S120, S18, S21 y S44), Por otro lado, se evidencio la presencia de 2 microalgas relacionadas con la clase de las Eustigmatophyceae ( S31 y S33) y solo una microalga relacionada con las Bacillariophyceae (S41) ambas clases relacionadas con el filo de las Ocrofitas, (Arbol 1). Por otro lado, cabe destacar que a inicios de verano de las Eustigmatophyceae solo se encontraron 2 microalgas relacionadas con esta clase, sin embargo a finales de verano se pudo aislar a 7, siendo las microalgas S50, S55, S61, S62, S64, S70 y S77 las únicas relacionadas con esta clase, no evidenciándose la presencia de microalgas cultivables de la clase de las Bacillariophyceae. De las 17 microalgas aisladas a finaes de verano (Arbol 2), 10 eran clorofitas, 3 de la clase Trebouxiophyceae (S81, S90 y S84) y 7 de las Chlorophyceae (S91, S97, S101, S112, S117, S120 y S121). De todas las microalgas aisladas, la que mejor resultados presento de cultivo y producción de biomasa y lípidos fue la microalga S21.
Se puede apreciar que para la clorofita S21 identificada como eucariota, cuya correspondencia genética es de un 99 % con Chlorococcum minutum, se obtuvo una concentración máxima de biomasa de 131 mg*L-1 con un valor de velocidad de crecimiento de 0,60 mg*hrL-1 a 10ºC por otro lado, un incremento de hasta un 300% en la concentración de biomasa se obtuvo cuando el cultivo se realizó a 20º C, en este ensayo también se aprecia un incremento del 100% de la velocidad de crecimiento con respecto al cultivo a 10 ºC, llegando a alcanzar un valor de 1,60 mg*hrL-1. Si bien se evidenció una fase lag de crecimiento en el ensayo a 10º C, esta no se evidenció cuando el ensayo se realizó a 20º C, cuyo crecimiento se mantuvo constante y en forma progresiva hasta el día 14 de cultivo, donde dio lugar a la fase estacionaria, lo que se tradujo en una concentración máxima de biomasa de 395 mg*L-1.
También, se quiso evaluar el efecto sobre la microalga S21 la utilización de distintas condiciones de cultivo, de manera de evaluar que condiciones se traducen en estrés o que factores promueven la síntesis de lípidos. Para ello se llevo una serie de ensayos en distintas condiciones y se evaluó mediante la técnica de citometría de flujo, la integridad celular, el estado de la membrana y la relación lípidos neutros y polares presentes en la célula, también se llevo a cabo un análisis cualitativo de los acidos grasos mediante cromatografía de gases acoplado a un detector de masa.
Se pudo comprobar que el efecto de la radiación lumínica sobre la polaridad de membrana de la microalga S21, puede mostrarnos una señal sobre lo que ocurre a nivel intracelular bajo diferentes condiciones de cultivo; en este sentido, el efecto de la luz conlleva un aumento en la actividad metabólica. En nuestro estudio, se pudo establecer una relación entre la cantidad de lípidos totales obtenidos y el aumento de actividad metabólica en función de la polaridad de membrana. La radiación lumínica por sí sola no parece inducir directamente la acumulación de lípidos, pero un exceso de radiación lumínica sí puede traducirse en un el efecto de estrés. En nuestros ensayos con la microalga S21, se obtuvieron resultados similares a los descritos por estos autores, llegándose a observar en la fase estacionaria un acúmulo celular de lípidos totales del orden del 67,6% a 20ºC tras 20 días en comparación a los 11,2% de lípidos totales en la fase exponencial bajo las mismas condiciones.
Nuestra microalga S21, al ser aislada de un ambiente con escaso contenido de nutrientes, es decir, un ambiente oligotrófico, podría dar una explicación al efecto reducido de estrés cuando se cultiva bajo condiciones reducidas de nutrientes, por lo que si atribuimos que el estrés es un factor importante en la formación de lípidos, ésta podría ser una explicación, del porqué se obtuvieron resultados similares de concentración de lípidos neutros, cuando se ensayaron ambas diluciones. También se pudo observar una clara diferencia en la producción de biomasa, entre los cultivos realizados a 20 y 10ºC, siendo los cultivos a 20ºC, donde se obtuvieron los mejores resultados. Estos resultados concuerdan con el estado fisiológico de la microalga, existiendo mayor cantidad de células viables con la capacidad de homeostasis intacta en los cultivos realizados a 20ºC, en comparación a los resultados obtenidos en los ensayos a 10ºC. Sin embargo, fue sólo en la fase de crecimiento estacionario donde, sí se pudo observar una diferencia significativa entre ambas temperaturas, apreciándose que en la fase exponencial los resultados de lípidos totales, viabilidad y polarización de membrana fueron muy similares; sin embargo, en la fase de crecimiento estacionaria (tras 20 días de cultivo) los niveles de lípidos totales aumentaron, como también la cantidad de ácidos grasos saturados e insaturados.
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