Caracterización biofísica de las regiones membranotrópicas de las proteínas no estructurales ns5a y ns4b del virus de la hepatitis c
- Autores: María Francisca Palomares Jerez
- Directores de la Tesis: José Villalaín Boullón (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jose Manuel González Ros (presid.), María Amparo Estepa Pérez (secret.), Francisco José Aranda Martínez (voc.), Manuel José Estevez Prieto (voc.), Juana Díez Antón (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El virus de la hepatitis C (HCV) afecta a más de 170 millones de personas en todo el mundo y la mayoría terminarán por desarrollar enfermedades hepáticas, como hepatitis crónica, cirrosis y hepatocarcinomas [122], las cuales son responsables de cientos de miles de muertes cada año. A pesar de su gran incidencia, no existe vacuna alguna que pueda evitar la infección viral y los agentes terapéuticos no son eficientes para contrarrestar la enfermedad [113].
Después de su descubrimiento hace más de 20 años, los conocimientos sobre el ciclo viral han estado siempre limitados debido a la dificultad que presenta el crecimiento del virus en cultivos celulares, pero gracias a numerosos datos obtenidos en sistemas de estudio tanto in vitro como in vivo se ha obtenido una visión general de la biología del HCV, aunque algunas veces con resultados contradictorios, debido a que el genoma viral del HCV es muy heterogéneo.
Las proteínas no estructurales del HCV son: las proteínas NS2 y NS3 con función proteasa, la proteína NS4A que actúa como cofactor de la actividad serín-proteasa de NS3, NS4B induce alteraciones en las membranas necesarias para la replicación del RNA y las proteínas NS5A y NS5, que intervienen en la replicación del virus. Todas ellas están asociadas a membranas del RE. Las proteínas no estructurales del virus están implicadas en procesos de alteración/interacción con la membrana de la célula hospedadora los cuales son necesarios para garantizar el ciclo replicativo del virus. De ahí que este virus posea regiones implicadas en dichos procesos, cuyas secuencias son conservadas en la mayoría de las estirpes. Nos propusimos como primer objetivo encontrar las regiones membranotrópicas de las proteínas no estructurales del HCV, principalmente las proteínas NS4B y NS5A, para estudiar su caracterización biofísica y utilizarlas como posibles dianas terapéuticas. Esta nueva estrategia podría permitirnos encontrar nuevos agentes terapéuticos contra el HCV.
La proteína NS4B es muy hidrofóbica, con un peso molecular de 27 KDa.
Está poco caracterizada y de función en principio desconocida. Recientemente se han descrito varias funciones para dicha proteína relacionadas con el ciclo replicativo del virus, además de diversos efectos que produciría en la membrana de la célula hospedadora. El papel de la proteína NS4B en el ciclo replicativo está relacionado con la regulación de dicho ciclo, ya que la proteína es capaz de modular la actividad de la proteína NS5B; lo más significante es que parece ser que es responsable de la formación de estructuras membranosas en la célula hospedadorea que son plataformas necesarias para la replicación del virus y que forma el complejo de replicación. Para estudiar las bases estructurales de dicha proteína en las membranas e identificar nuevas dianas terapéuticas hemos realizado un análisis de las diferentes regiones de la proteína NS4B que podrían interaccionar con las membranas fosfolipídicas. Tras la localización de las regiones membranotrópicas, hemos realizado una exhaustiva caracterización de la interacción de ellas con diferentes sistemas modelo de membrana. Hemos encontrado la región AH2 como una de las regiones más membranotrópicas de la proteína NS4B, la cual puede estar implicada en el proceso de alteración de la estructura de la membrana de la célula hospedadora y debido a su actividad de oligomerizar podría formar un dominio TM que haría cambiar la topología de la proteína. Estudiando la estructura primaria de la proteína NS4B determinamos la posición y localización de varios dominios transmembrana basados en la transferencia de energía libre entre agua-bicapa y agua-interfase. Hemos propuesto el segmento H1 y H2 de la proteína NS4B localizados en el extremo C-terminal como dominios implicados en la interacción con membrana similar a dominios encontrados en otras proteínas. Además el extremo C-terminal de la proteína NS4B sería esencial para la replicación y una potente diana terapéutica para la búsqueda de inhibidores. Péptidos derivados de las regiones anteriormente nombradas, son capaces de unirse a la superficie de la membrana con alta afinidad y modular las propiedades biofísicas de los fosfolípidos.
Su localización en la superficie les permitiría perturbar la arquitectura y desestabilizar la membrana de la célula hospedadora. Estos datos sugieren que las regiones de la proteína NS4B donde se localizan estos péptidos pueden ser fundamentales para el proceso de replicación del virus. Hemos estudiado la región a la que se le atorga la actividad ATPase presente en dicha proteína, y hemos analizado el péptido derivado de esta región el cual ha sido capaz de inducir perturbaciones en las membranas modelo y de unirse a la bicapa lipídica.
Esta región también podría ser esencial durante el proceso de replicación del virus, de manera que podría implicar que la proteína NS4B necesita la interacción con la membrana de la celúla hospedadora para que se de la replicación del HCV.
La proteína NS5A es una proteína de 56-58 KDa, que intervine en la replicación del virus así como en su regulación. Su extremo N-terminal (1-30 aa) contiene una hélice ¿ necesaria y suficiente para localizar a dicha proteína en la membrana del retículo endoplasmático y de esa manera poder formar el complejo de replicación. Está constituida por tres dominios, denominados I, II y III, respectivamente. El dominio I se encuentra en la región N-terminal de la proteína y presenta un motivo de unión a Zn formado por varias Cys; dicha región está altamente conservada en el género de los hepacivirus como en el de los pestesvirus. Se ha observado que tanto mutaciones en la hélice ¿ y en el sitio de unión a Zn inhiben la replicación del RNA. Nosotros hemos analizado la región hélice ¿ correspondiente al segmento N-terminal de la proteína NS5A de dos cepas diferentes del HCV. Hemos caracterizado la interacción de dicho segmento con membranas modelo y los resultados obtenidos nos sugieren que dicha región es un elemento necesario para la interacción de la proteína con la membrana. Además dicha región podría permitir el desarrollo de de nuevas estrategias antivirales basadas en inhibidores del ciclo replicativo de virus.
Por tanto, podemos concluir que las diferentes regiones membranotrópicas estudiadas son segmentos necesarios y esenciales para que las proteínas nativas interacionen directamente con la membrana celular y de esa manera el ciclo replicativo funcione eficazmente. La hipótesis de partida es que si estas regiones no interaccionan con la membrana, el proceso de replicación del virus podría alterarse y por el ello virus perdería su capacidad de replicarse dentro de la célula hospedadora. Estos estudios por tanto posibilitarían el desarrollo de compuestos anti-HCV dirigidos a evitar la replicación del virus.
Las regiones membranotrópicas detectadas en este trabajo podrían ser utilizadas como dianas terapéuticas permitiendo el desarrollo de nuevas estrategias clínicas.
