El neutrófilo como célula reguladora y efectora en la respuesta inmune alérgica
- Autores: Inmaculada Ventura Fernandez
- Directores de la Tesis: Francisco Javier Monteseirín Mateo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ramón Pérez Cano (presid.), María José Torres Jaén (secret.), Manuel Prado Castaño (voc.), Yolanda Maria Puente Crespò (voc.), Lourdes Fernández Delgado (voc.)
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- Resumen
LA ALERGIA Y LOS NEUTRÓFILOS La alergia o atopia es una entidad descrita en el hombre a principios del siglo XX, sus causas y mecanismos aún están en estudio. Afecta al 35% de la población en los países industrializados y comprende un amplio abanico de afecciones tales como la rinitis, el asma, la dermatitis atópica, las alergias alimentarias, etc. En el desarrollo del proceso alérgico intervienen factores genéticos y medioambientales, pero sus conexiones internas y su prevalencia aún no están del todo dilucidadas. Desde hace años se conoce que las reacciones alérgicas son causadas como consecuencia de un proceso de hipersensibilidad. Así se denomina a la respuesta inmune que se produce de forma exagerada o inapropiada, causando fenómenos inflamatorios y lesiones titulares.
1.1. LA INFLAMACIÓN ALÉRGICA La llamada inflamación alérgica se caracteriza por ser un fenómeno dual o bifásico que consta de una primera fase o respuesta inmediata consecutiva a la liberación de mediadores primarios a partir de las llamadas células efectoras primarias, representadas por los neutrófilos, mastocitos y basófilos (figura 1), seguida de una segunda fase o retardada más prolongada caracterizada por la infiltración del foco inflamatorio por células efectoras secundarias entre las que destacan fundamentalmente los eosinófilos y los neutrófilos que van a liberar a su vez otros mediadores inflamatorios secundarios responsables de la respuesta tardía [1].
Para que se produzca la inflamación alérgica, se requiere una etapa de sensibilización previa que se inicia con la captación y procesamiento del antígeno por las células presentadoras de antígenos, continúa con la presentación del mismo al linfocito T CD4+ y consiguiente reconocimiento por parte de éste y finalmente con la interacción entre las células T y B, en donde intervienen tanto interacciones celulares directas como interleuquinas liberadas por los linfocitos T, que conduce a la producción de anticuerpos de la clase IgE responsables de la sensibilización de las células efectoras primarias, mastocitos y basófilos.
En el transcurso del proceso inflamatorio, como consecuencia de la activación de diferentes poblaciones celulares, se va a provocar un aumento de la liberación de citoquinas y quimioquinas algunas de las cuales tienen capacidad para inducir la expresión en las células endoteliales de moléculas de adhesión. Estas moléculas de adhesión junto con las quimioquinas presentes en las células endoteliales van a favorecer la migración leucocitaria hacia el foco inflamatorio al interaccionar con otras moléculas de adhesión y receptores presentes en la superficie de las células migratorias.
Una vez que estas células migratorias o efectoras de la inflamación, entre las que destacan los eosinófilos y los neutrófilos, alcanzan el foco inflamatorio, donde son reclutadas y activadas, comienzan a segregar una serie de mediadores secundarios proinflamatorios. De este modo se origina una compleja trama de interacciones y de amplificación de la respuesta alérgica.
Las manifestaciones clínicas de las reacciones alérgicas IgE-mediadas derivan de los fenómenos inflamatorios que se producen como consecuencia de la generación y liberación de productos solubles por determinadas estirpes celulares.
A pesar de que se reconoce la patología atópica como un proceso en el cual se induce la liberación de mediadores y el acúmulo de células inflamatorias en el órgano de choque, y de que varias de estas células inflamatorias (macrófagos, linfocitos, mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y plaquetas) han demostrado estar implicadas en la reacción alérgica, el papel desempeñado por cada una de ellas no está del todo aclarado. Debido a la naturaleza crónica de los procesos alérgicos, los leucocitos que persisten en los tejidos, especialmente eosinófilos y linfocitos, han sido los más estudiados. Hasta hace poco tiempo se tenía una escasa noción del papel que podía ejercer el neutrófilo en la reacción alérgica, una célula con un potencial proinflamatorio y lesional importante y que se encuentra presente en el foco inflamatorio alérgico. Sin embargo, existen fuertes evidencias experimentales de la participación de los neutrófilos en los procesos alérgicos [2, 3]. Así, se ha comprobado en éstos un aumento de la actividad quimiotáctica y quimioquinética, expresión de marcadores de activación (entre los que destacan las moléculas de adhesión), alteración de la respuesta a diversos agentes reguladores, producción de leucotrienos, liberación de componentes de los diversos gránulos citoplasmáticos, y generación y liberación de metabolitos del oxígeno. Y parece confirmarse por las investigaciones de los últimos años que el neutrófilo es una célula que interviene directa (a través de mecanismos IgE-dependientes) e indirectamente (por su acción sobre otras estirpes celulares) en la inflamación alérgica.
1.2. LOS NEUTRÓFILOS Los neutrófilos constituyen el 60-70% de todos los leucocitos en sangre periférica y algunos están presentes en el tejido conectivo; según la morfología del núcleo se distinguen dos tipos: células en banda y células segmentadas; las primeras son neutrófilos jóvenes, cuyo núcleo está indentado; en las segundas, formas maduras, se observa el núcleo constituido por un número de lóbulos que oscila entre 2 y 5, conectados por finos filamentos de cromatina.
Presentan un diámetro aproximado de 10-20 ¿m y se caracterizan porque presentan un núcleo multilobulado visible al microscopio óptico con tinción Giemsa (figura 2). Los neutrófilos, no presentan nucleolo y no pueden dividirse ni diferenciarse. El citoplasma contiene un gran número de gránulos. Se distinguen tres tipos de gránulos (figura 3) que pueden ser distinguidos por los distintos componentes que contienen [4, 5]. Nombrados por el orden de aparición en las células progenitoras de la médula ósea son los siguientes: primarios o azurófilos, secundarios o secretorios o específicos y terciarios. Los gránulos primarios o azurófilos son lisosomas que contienen las enzimas necesarias para la digestión intracelular y diversos compuestos con actividad bactericida (fosfatasa ácida, arilsulfatasa, ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa, lisozima, mieloperoxidasa, proteínas catiónicas), los gránulos secundarios o específicos contienen lisozima, proteasas neutras (colagenasa), fosfatas alcalina y lactoferrina. Y por último los gránulos terciarios o de gelatinasa.
La función primordial de los neutrófilos es la defensa del huésped, específicamente la fagocitosis y destrucción de los agentes patógenos en los tejidos. La célula responde a estímulos quimiotácticos generados en el tejido afectado que inducen la adherencia a las células endoteliales y diapédesis a través de la pared de los vasos de la microcirculación hacia el lugar de la lesión, donde intentará destruir al agente causante de ésta. Por eso, el proceso de acumulación de los neutrófilos en los tejidos para la defensa del huésped es esencial para la supervivencia. Esta acumulación es un proceso controlado resolviéndose el proceso inflamatorio de forma aguda con la desaparición del agente causante. Sin embargo, si los mecanismos de control fallan, existe una respuesta exagerada o persiste el estímulo (como sucede en los enfermos alérgicos), la acumulación y activación de los neutrófilos contribuyen a la lesión tisular. Los gránulos de gelatinasa se movilizan más exhaustivamente durante la extravasación, que los gránulos específicos y azurófilos, lo cual puede ser crucial porque la liberación de proteína colagenolítica como es la gelatinasa puede facilitar la migración del neutrófilo al tejido perivascular [6]. Por otra parte, los gránulos específicos y azurófilos (que contienen más enzimas destructoras de tejidos y sustancias bactericidas), sufren exocitosis parcialmente. Una explicación para esta liberación durante la extravasación es que el neutrófilo se activa por el contacto íntimo con el endotelio y la matriz extracelular.
1.3. METALOPROTEASAS: CLASIFICACIÓN, ESTRUCTURA Y FUNCIÓN Las metaloproteasas (MMPs), también llamadas matrixinas, son una familia de más de 20 endopeptidasas que contienen zinc y que son capaces de degradar diferentes componentes de la matriz extracelular (ECM) [7]. Todas son producidas como pro-enzimas, que deben ser procesadas proteolíticamente para ser activadas. En la figura 4 vemos que las MMPs se clasifican en cinco grupos en base a su estructura y/o sustrato. La subclase más simple de MMPs son las matrilisinas, que constan de un péptido señal, un dominio propéptido y un dominio catalítico con el sitio de unión a zinc. Las colagenasas además de esta estructura mínima contienen un dominio tipo hemopexina conectado al dominio al dominio catalítico por una región bisagra rica en prolina, degradan las hélices nativas de tipo I, II, III y otros colágenos fibrilares. Las estromelisinas tienen dominios estructurales similares a las colagenasas, pero como las matrilisinas, tienen una amplia especificidad de sustrato y degradan muchas proteínas de la ECM, incluyendo proteoglicanos, fibronectina y laminina. Las gelatinasas contienen una región adicional de tres repeticiones de fibronectina tipo II en su dominio catalítico y muestran preferencia por colágenos desnaturalizados (gelatina) y también degradan colágenos nativos tipo IV, V, VII y X. El quinto y mayor subgrupo de MMPs son las MMPs de tipo membrana (MT-MMPs). Estas MMPs están unidas a la superficie celular por un dominio C-terminal transmembrana o un ancla de glicofosfatidilinositol, y degradan gelatina, fibronectina, y agrecano así como otros sustratos de la ECM [8].
El propéptido de todas las MMPs contiene un residuo conservado de cisteína, llamado ¿botón cisteína¿ cuyo grupo sulfidrilo coordinado con el ión zinc en el sitio catalítico mantiene la latencia. La interrupción de esta unión cisterna-zinc de forma física o química es el primer paso en la activación de las MMPs [7, 9] El dominio hemopexina, que forma una estructura en hélice de cuatro hojas hechas de láminas ¿, permite a las MMPs colagenolíticas distorsionar la triple hélice de colágeno para que el dominio catalítico pueda romperla [10]. El dominio hemopexina también es necesario para la unión de la MMP a otras proteínas, incluyendo integrinas, receptores de superficie celular e inhibidores titulares. Además el dominio tipo fibronectina de las gelatinasas es importante para su unión a la gelatina. Todas las MT-MMPs tienen una secuencia de reconocimiento furina entre su propéptido y su dominio catalítico, permitiendo la rotura/activación por enzimas convertasas de furina en el aparato de Golgi. Excepto estas MMPs activadas intracelularmente por furina proteasas, las demás son secretadas como zimógenos inactivos que deben ser activados en el espacio extracelular por rotura proteolítica del dominio propéptido N-terminal [11].
Aunque las MMPs fueron consideradas inicialmente enzimas degradadoras de matriz, sus funciones se han expandido desde la remodelación de la ECM a múltiples mecanismos de inmunomodulación. En la respuesta inmune normal a una infección las MMPs tienen un importante papel degrandando los componentes de la ECM y modulando la actividad quimiotáctica y citoquínica. La migración de las células inmunes a los sitios de inflamación desde el torrente sanguíneo requiere la proteolisis de la membrana basal [12-14]. Además las MMPs modulan gradientes quimiotácticos y citoquínicos que conducen al reclutamiento de células inflamatorias [15]. Las MMPs intervienen en otras funciones fisiológicas como el desarrollo, la angiogénesis, el ciclo menstrual y la remodelación del hueso y en enfermedades donde predomina un crecimiento aberrante de la ECM tales como la artritis, la invasión de tumores y la arterosclerosis [16, 17].
1.3.1. LA METALOPROTEASA-9 La metaloproteasa-9 (MMP-9) es una de las más de 20 metaloproteasas dependientes de zinc con propiedades gelatinolítica y elastinolítica. Pertenece al grupo de las gelatinasas y es secretada por numerosos tipos celulares como neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, celulas epiteliales y fibroblastos. Existen cuatro formas diferentes de MMP-9: una pro-forma biológicamente inactiva (92 kDa), una forma activa (88 kDa), un heterodímero (125 kDa) formado por la MMP-9 y la proteína lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) y un homodímero de 220 kDa. La figura 5 A muestra los dominios estructurales básicos de la MMP-9 y la figura 5 B una estructura en tres dimensiones de esta proteína.
La degradación de ECM por parte de la MMP-9 tiene un importante papel en el deterioro pulmonar. Sin embargo, tiene además un amplio espectro de funciones dada su actividad catalítica contra una gran variedad de sustratos como gelatina, elastina, agrecano, fibronectina, vitronectina, entactina y colágenos tipo IV, V, VII, IX, X y XIV, todos ellos componentes de la ECM. También la MMP-9 es capaz de romper otros sustratos como quimioquinas, teniendo esto importantes consecuencias locales durante la respuesta inflamatoria [17, 18]. La MMP-9 tiene un papel muy importante en la remodelación y reparación de la ECM así como la regulación de la respuesta inmune cuando se produce daño pulmonar. Y también está implicada en la patogénesis de varias enfermedades como el asma así como en enfermedades que afectan a otros órganos [16-21].
Este trabajo, sigue la línea de investigación que el Servivio de Inmunología y Alergia realiza sobre la participación directa del neutrófilo en la respuesta alérgica, estudiando las posibles modificaciones sobre aspectos funcionales de los neutrófilos de enfermos alérgicos y su comportamiento tras estímulos específicos.
Esta demostrada la presencia de moléculas de IgE en la superficie de neutrófilos. Esto significa que si estas células poseen receptores de IgE y moléculas de IgE en su superficie, cabe la posibilidad de que puedan estimularse por un mecanismo dependiente de esta inmunoglobulina, elemento clave de las reacciones alérgicas. Efectivamente, nuestro grupo demostró como esta célula podía activarse por este mecanismo e incluso se pudo comprobar, por citometría de flujo y por microscopía de fluorescencia, como los alergenos se unían a la superficie de los neutrófilos de una forma específica.
La exocitosis juega un papel muy importante en la fisiología del neutrófilo. La secreción de los distintos gránulos parece regular las respuestas tempranas de estas células, como la adhesión y extravasación de las mismas. Los neutrófilos poseen varios gránulos: los azurófilos o gránulos primarios, los secundarios o específicos, los terciarios, ricos en gelatinasa y otros orgánulos denominados vesículas secretorias. La MMP-9 es una endopeptidasa responsable de la degradación de la ECM, que se encuentra presente en los gránulos terciarios de los neutrófilos y que se revela cada vez más como una pieza fundamental en los acontecimientos fisiopatológicos ligados a la infección e inflamación.
Para la realización del presente estudio nos planteamos los siguientes objetivos: 1º. Estudiar si existe un mecanismo IgE-dependiente para la liberación de MMP-9 desde gránulos terciarios del neutrófilo en los pacientes alérgicos.
2º. Comprobar si existe una modulación dosis-dependiente y tiempo-dependiente en la liberación de la MMP-9 tras la exposición antígeno-específica o a anticuerpos anti-IgE, una vez demostrado el anterior apartado.
3º. Estudiar si los receptores de IgE, presentes en la superficie celular del neutrófilo son responsables de la liberación de la MMP-9.
4º. Comprobar que la MMP-9 liberada desde neutrófilos de pacientes alérgicos es biológicamente activa, teniendo actividad gelatinolítica, mediante la realización de una enzimografía.
3.1. PACIENTES El grupo seleccionado para nuestro trabajo está constituido por pacientes adultos atópicos con clínica de rinitis y/o asma bronquial alérgica que acuden a las consultas externas del Servicio Regional de Inmunología y Alergia, en el Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla.
3.2. MATERIAL Anticuerpo anti- Fc¿RI (eBioscience, USA).
Anticuerpo anti- Fc¿RII (IZASA-Immunotech, Barcelona, España).
Anticuerpo anti-CD9 de ratón (Immunotech-IZASA, Barcelona, España).
Anticuerpo anti-galectina-3 (Abcam, Reino Unido).
Anticuerpo de cabra anti-IgE humana (Caltag).
Anticuerpo de cabra anti-IgG humana (Caltag).
Anticuerpo IgG de cabra anti-ratón con bolas micromagnéticas (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemania).
Cámara de Neubauer (Assistent).
Centrífuga con termostato (Jouan).
Centrifugadora (Jouan).
ClNa al 1,8% (Sigma, USA, América).
Columna imantada de acero (Dynal MPC-6®, Dynal AS. N-0212, Oslo, Noruega).
Dextrano T-500 al 0,7% (pharmacia Biotech, Upsala, Suecia).
Ficoll-Hypaque (d = 1,077) (Bio-Wittaker, USA, América).
fMLP ( N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine) (Sigma-Aldrich, Madrid).
Gelatina (Serva).
H2O destilada desionizada.
Lector de placas.
L-Glutamina (Bio-Whittaker, Bélgica).
Microscopio óptico (Nikon).
Penicilina (Bio-Whittaker, Bélgica).
Pipetas graduadas (Finnipippette).
Pipetas Pasteur.
RMPI- 1640 culture médium (Bio-Whittaker, Bélgica).
Secador de geles (Biorad).
Solución azul tripan al 0,4%, disuelto en ClNa al 0,9% (Serva).
Solución salina tamponada con fosfatos (PBS) (Bio-Whittaker, Bélgica).
Streptomicina (Bio-Whittaker, Bélgica).
Suero fetal bovino (Bio-Whittaker, Bélgica).
Tubos de ensayo heparinizados (Vacutainer).
3.3.1 PREPARACIÓN DE LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES Los neutrófilos humanos son purificados tras la extracción de 10 ml de sangre venosa periférica, la cual es recogida en un tubo de ensayo heparinizado (figura 6).
A esta sangre heparinizada le agregamos Dextrano T-500 y lo mezclamos cuidadosamente durante 2 minutos mediante agitación de 90º y se deja sedimentar unos 45-60 minutos.
Transcurrido este tiempo, extraemos con cuidado el sobrenadante de color amarillento con una pipeta Pasteur y se vierte cuidadosamente sobre un tubo de ensayo que contiene Ficoll-Hypaque, en proporción 1:2 de Ficoll:sangre, haciendo resbalar el sobrenadante sobre la pared del tubo para evitar que se mezclen y pueda quedar sobre el Ficoll. A continuación centrifugamos a 2000 r.p.m. durante 20 minutos a 4ºC.
Después de esta centrifugación, nos encontramos con diferentes fracciones (de arriba a bajo): plasma, anillo linfocitario (donde se encuentran los linfocitos y monocitos), Ficoll, y abajo un precipitado rojizo donde se encuentran los neutrófilos y hematíes. Primero se extrae el anillo de linfocitos y monocitos y después el resto de sobrenadante, quedando sólo el botón de neutrófilos y hematíes.
Al pellet rojizo, le realizamos un choque hemolítico hipotónico para romper los hematíes: resuspendemos el precipitado añadiendo 5 ml de agua destilada y desionizada (H2Odd), y a continuación añadimos rápidamente (en menos de 30 segundos) 5 ml de ClNa al 1,8% que devuelve la solución a una concentración isotónica. La suspensión celular se centrifuga a 1200 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC. Los precipitados resultantes se someten a dos procesos de lavado por resuspensión en 10 ml de PBS y centrifugación a 1200 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC.
Finalmente, descartando el sobrenadante, el pellet celular conseguido, que corresponde a neutrófilos humanos, se resuspende en PBS sin glucosa, Ca++ ni Mg++, para evitar la activación celular.
Para una mayor purificación celular llevamos a cabo la separación de los eosinófilos que pueden identificarse en base a su carácter de granulocitos CD9 positivo. Por tanto, la preparación de neutrófilos se incuba con anticuerpos anti-CD9 de ratón y posteriormente con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón con bolas micromagnéticas. Neutrófilos y eosinófilos son separados tras su paso por una columna imantada, los eosinófilos con bolas anti-CD9 son fijados a las paredes de la columna, mientras los neutrófilos se desplazan al fondo de la misma.
Una vez aislados los neutrófilos, se procede a su contaje y a la comprobación de su viabilidad.
La viabilidad de las células obtenidas se determina mediante el test de exclusión azul tripan. El azul tripan es un colorante que penetra en células con perdida de la integridad de sus membranas, apareciendo éstas teñidas de azul al microscopio. La suspensión de células se diluye con PBS (dilución 1:10 ó 1:100). Después, en un tubo se mezclan 80 ¿l de PBS, 10 ¿l de esta mezcla y se añaden a una cámara de Neubauer 0.0025 mm2. En el microscopio óptico a 40 aumentos se cuentan las células localizadas en las zonas de 4 x 4 casillas de la cámara. Para calcular el número de células y el porcentaje de viabilidad celular, se aplican las siguientes fórmulas:
nº células/ml = media de células contadas x 104 x dilución (10 ó 100) % viabilidad = (células blancas o no teñidas / células totales) x 100 3.3.2. CULTIVO Y DETERMINACIÓN DE MMP-9 Una vez separados los neutrófilos tal y como hemos descrito anteriormente procedimos a la determinación de la MMP-9 secretada por los mismos tras ser estimulados.
Los neutrófilos obtenidos se cultivan en medio RPMI completo (RPMI suplementado con 10% (v/v) de suero fetal inactivado, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 ¿g/ml de estreptomicina). En placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 5 x 10 6 células/ml. Se mantienen a una temperatura de 37ºC y en una atmósfera del 5% de CO2 y 95% de O2.
Las células se recogen y se centrifugan a 14000 r.p.m. durante 1 min. Los sobrenadantes obtenidos se almacenan a -80ºC hasta su uso. La determinación de los niveles de MMP-9 se realiza por ELISA, con kits comerciales, siguiendo las instrucciones en ellos detalladas.
La MMP-9 liberada en el sobrenadante del cultivo celular obtenido es medida por el método de Enzima Immunoensayo (ELISA) para MMP-9 obtenido de Calbiochem (Madrid, España). Las muestras fueron diluidas previamente 1:100 antes de su análisis. El límite de sensibilidad determinado por el proveedor era de 0¿1 ng/ml.
3. 3. 3. CULTIVO Y MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA MMP-9 Los neutrófilos obtenidos se cultivan en medio RPMI completo (RPMI suplementado con 10% (v/v) de suero fetal inactivado, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 ¿g/ml de estreptomicina). En placas de cultivo de 24 pocillos a una densidad de 1 x 10 6 células/ml. Se mantienen a una temperatura de 37ºC y en una atmósfera del 5% de CO2 y 95% de O2. Las células se recogen y se centrifugan a 14000 r.p.m. durante 1 min. Los sobrenadantes obtenidos se almacenan a -80ºC hasta su uso.
Se añade buffer Laemmli no reductor a los sobrenadantes, y las proteínas se separan inmediatamente en geles SDS-PAGE que contienen 1mg/ml de gelatina. Siguiendo a la electroforesis, los geles se lavaron en un buffer de lavado (2¿5% triton X-100) durante 15 minutos e incubaron a continuación en un buffer de reacción (50 mM tric HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 y 0¿02% NaN3) a 37ºC durante 18 horas. Los geles fueron teñidos con Coomassie blue R-250 (0¿1% en metanol 40% y ácido acético 10%) durante 15 minutos y posteriormente desteñidos en metanol 40% y ácido acético 10%.
4.1. INDUCCIÓN DE MMP-9 POR ANTICUERPOS ANTI-IgE Y ALERGENOS EN NEUTRÓFILOS HUMANOS DE PACIENTES ALÉRGICOS En los experimentos iniciales se analizó si la anti-IgE ó los alergenos afectaban de alguna forma a la liberación de MMP-9 en neutrófilos humanos de pacientes alérgicos. Con este objetivo se obtuvieron células de pacientes alérgicos sensibilizados a alergenos específicos como Olea europea (T9) y Dermatophagoides pteronyssinuss (D1) y se cultivaron en presencia de estos alergenos, anticuerpos anti-IgE o fMLP, estudiandose la cantidad de MMP-9 liberada al medio mediante ELISA. La figura 7 muestra que un incremento en la liberación de MMP-9 tiene lugar cuando los neutrófilos son incubados en presencia de fMLP, que utilizamos como control positivo, así como en presencia de anti-IgE y alergenos específicos a las dosis y tiempos indicados.
A continuación realizamos experimentos para analizar la dosis óptima para la liberación de MMP-9 y el tiempo óptimo para esta respuesta. La figura 8 muestra que la liberación de la proteína comienza a incrementarse a partir de 0¿5 ¿g/ml para anti-IgE y de 1 ¿g/ml para alergenos. Obteniéndose el pico máximo de liberación a la concentración de 20 ¿g/ml para la anti-IgE y de 40 ¿g/ml para alergenos. A estas concentraciones óptimas, la proteína se detecta desde los 30 minutos alcanzádose la máxima liberación a las 24 horas en ambos casos.
4.2 LIBERACIÓN DE MMP-9 EN RESPUESTA A ANTICUERPOS CONTRA Fc¿RI, Fc¿RII/CD23 y GALECTINA-3 Estudios previos demuestran la presencia de las tres formas de receptores de IgE. El receptor de alta afinidad para IgE (Fc¿RI), el receptor de baja afinidad (Fc¿RII/CD23) y la galectina-3 se encuentran en la superficie de neutrófilos humanos. Alergenos específicos son capaces de activar respuestas funcionales desde neutrófilos humanos de pacientes alérgicos sensibilizados a alergenos del mismo tipo a los que producen síntomas alérgicos clínicos. En el siguiente experimento incubamos neutrófilos humanos de pacientes alérgicos con anticuerpos contra estos receptores Fc¿RI, Fc¿RII/CD23) y la galectina-3 (5¿g/ml). La figura 9 muestra los resultados obtenidos, observándose un incremento en la MMP-9 liberada. El control negativo con anti-IgG no produjo ningún incremento apreciable en los niveles de MMP-9.
4.3. ACTIVIDAD GELATINASA: ENZIMOGRAFÍA En este estudio demostramos que la MMP-9 liberada desde neutrófilos humanos de pacientes alérgicos tiene actividad gelatinolítica. La enzimografía de gelatina se realizó en geles de arcrilamida, conteniendo gelatina, como hemos descrito previamente en la sección de materiales y métodos. Las bandas claras aparecieron en las zonas del gel donde la gelatina había sido degradada, indicando esto la presencia de actividad gelatinasa. Los sobrenadantes de pacientes asmáticos mostraron bandas de 92 KDa, que corresponden a la pro-MMP-9. La forma activa de MMP-9, de 85 KDa, era detectable solo en algunos sujetos (datos no mostrados). La figura 9 muestra que sin estímulos los neutrófilos liberan MMP-9 espontaneamente. Además de aumentar significativamente los niveles da la MMP-9 liberada cuando las células son estimuladas con fMLP, anti-IgE y alergenos específicos a las dosis y tiempo indicadas.
5.1. PARTICIPACIÓN DE LOS NEUTRÓFILOS EN LOS PROCESOS ALÉRGICOS Muchas células están implicadas en la fisiopatología de los procesos atópicos. Está bien probada la contribución de mastocitos, linfocitos y eosinófilos. Sin embargo, en una reciente revisión se indica como sólo el 50 % de los casos de asma están asociados con una inflamación eosinofílica y en la mayoría de los otros casos se encuentra en las vías aéreas un aumento de neutrófilos y de interleukina 8 (IL-8) [22].
Los neutrófilos son leucocitos polimorfonucleares, que juegan un papel esencial en el sistema inmune, siendo la primera línea de defensa contra las infecciones por bacterias y hongos. Inicialmente se pensó que su papel en la inflamación estaba restringida a su capacidad de fagocitosis y de liberación de enzimas y otros agentes citotóxicos. Sin embargo, en la actualidad se conoce como estas células pueden liberar diversos mediadores que pueden ejercer un profundo efecto en las vías aéreas de individuos asmáticos. Entre ellos se incluyen a proteasas, que puede destruir la matriz extracelular tales como las MMPs. Y también pueden liberar radicales tóxicos de oxígeno [23, 24]. Los neutrófilos son también fuente de citoquinas tales como el factor de necrosis tumoral-¿ (TNF-¿), interleukina-1¿ (IL-1¿), IL-6, IL-8 e IL-12 [25]. En la actualidad, existen cada día más evidencias de la participación de los neutrófilos en los procesos alérgicos.
La exocitosis juega un papel muy importante en la fisiología del neutrófilo tal y como ya hemos comentado anteriormente. La secreción de los distintos gránulos parece regular las respuestas tempranas de estas células, como la adhesión, extravasación de las mismas, así como el inicio del estallido respiratorio. Como hemos indicado en la introducción, los neutrófilos poseen varios gránulos: los azurófilos o gránulos primarios, definidos por su contenido en mieloperoxidasa y elastasa; los secundarios o específicos, ricos en lactoferrina; los terciarios, ricos en gelatinasa y otros orgánulos denominados vesículas secretorias con predominio de fosfatasa alcalina. Los gránulos azurófilos contienen un gran número de enzimas líticos que pueden lesionar el tejido adyacente si se liberan por un mecanismo fuera de control. Los específicos y terciarios constituyen un reservorio de proteínas de la membrana plasmática celular, que se traslocan a la superficie de la misma después de la activación celular. Al mismo tiempo, contienen una amplia gama de proteínas envueltas en la adhesión y extravasación de los neutrófilos humanos, así como enzimas implicados en la generación de mediadores solubles de la inflamación.
Los diferentes gránulos poseen funciones fisiológicas distintas, por lo que la exocitosis de los mismos se regula por mecanismos independientes, tanto que la degranulación de los azurófilos puede realizarse sin que se efectúe la de los secundarios y viceversa [26].
5. 2. PAPEL DE LA MMP-9 EN LOS PROCESOS ALÉRGICOS Los neutrófilos son la subclase más abundante de leucocitos en sangre periférica. Y son la primera línea de defensa contra patógenos bacterianos. Aunque los neutrófilos son críticos en la defensa del huésped, una inapropiada infiltración y activación puede llevar a daños tisulares severos. En el pulmón, la infiltración neutrofilica y la activación está asociada al asma severa. El asma bronquial está caracterizada por una obstrucción bronquial reversible con inflamación de las vías aereas. Estos procesos inflamatorios son inducidos por complejas reacciones entre células inflamatorias, entre las que se encuentran los neutrófilos, y la liberación de las proteínas de sus gránulos [27, 28]. El desarrollo de una reacción de hipersensibilidad inmediata implica varios eventos bioquímicos que permiten la liberación de histamina, ácido araquidónico y otras moléculas efectoras. Todas las células inflamatorias tales como linfocitos, mastocitos, eosinófilos, neutrófilos y plaquetas están implicadas en el asma [29-31]. La pérdida progresiva de función pulmonar está acompañada de numerosos cambios patológicos de las vías aéreas, incluyendo fibrosis de la ECM de las vías aéreas [32, 33]. Varios investigadores han demostrado la relación entre la MMP-9 y los procesos alérgicos. Estos estudios demuestran que granulocitos circulantes de sujetos sanos y pacientes asmáticos producen espontáneamente tanto pro-MMP-9 como su forma activa [34-36]. Además existe la evidencia de que la MMP-9 es secretada durante la migración de los neutrófilos a través de la membrana basal [37] y se han encontrado altos niveles de MMP-9 en el esputo de pacientes asmáticos que derivarían parcialmente del proceso de activación de los neutrófilos. Todos estos datos sugieren un importante papel de los neutrófilos en la reacción aguda a alergenos y que estas células parecen jugar un gran papel en la inflamación alérgica.
5.3. LIBERACIÓN DE MMP-9 POR MECANISMOS DEPENDIENTES DE IgE DESDE NEUTRÓFILOS DE PACIENTES ALÉRGICOS Nuestro grupo ha demostrado cómo los gránulos primarios se liberan mediante un mecanismo dependiente de la IgE. Puesto que los gránulos terciarios juegan también un papel trascendental en la respuesta del neutrófilo, y dado que una de las sustancias contenidas en los mismos es la MMP-9, hemos querido comprobar mediante el estudio de la misma si efectivamente se podía realizar también una exocitosis de estos gránulos por un mecanismo IgE mediado.
En este estudio analizamos si los neutrofilos de pacientes alergicos liberan MMP-9 a través de un mecanismo mediado por IgE. Se ha demostrado que diversos mediadores entre los que se encuentran en fMLP, la IL-8 y el phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) inducen la liberación de MMP-9 desde neutrófilos y otros tipos celulares [34-37]. Nosotros hemos examinado la capacidad de los neutrófilos de sangre de pacientes alérgicos para liberar MMP-9 en respuesta a fMLP, anti-IgE o alergenos específicos. Como podemos ver tanto por ensayos ELISA como por las enzimografías realizadas, los neutrófilos de pacientes alérgicos que constitutivamente producen y almacenan MMP-9 en sus gránulos incrementaron la liberación de MMP-9 en respuesta a la estimulación con fMLP, anti-IgE y alergenos Estos experimentos proporcionan la primera evidencia de que los neutrófilos de pacientes alérgicos liberan MMP-9 por mecanismos IgE dependientes.
Tras realizar una cinética para conocer el tiempo idóneo de estimulación de los neutrófilos para conseguir la máxima liberación de MMP-9, llegamos a la conclusión de que el tiempo óptimo de estimulación era de 24 horas. Esto discrepa de la liberación de ciertos mediadores como la elastasa y mieloperoxidasa, que ocurre de modo óptimo a los 30 minutos, pero no siempre sucede así puesto que para la liberación de IL-8 y la ECP son necesarias 18 horas de incubación con el alergeno para dar su mejor rendimiento, tal y como hemos comprobado en otros de nuestros estudios [38-40].
La cantidad de alergeno o anti-IgE, al igual que el tiempo, necesario para que tenga lugar la óptima liberación del mediador, varía en los múltiples estudios realizados dependiendo de diversos factores tales como el alergeno utilizado, la célula manejada en el estudio [41-44] y por supuesto el mediador a estudiar. En términos generales y basándonos en estudios realizados anteriormente en células mononucleares en los que la cantidad de alergeno manejada fluctuaba en un rango relativamente amplio tomamos en principio como referencia un rango que oscilara alrededor de 10 ¿g/ml [45], cantidad de alergeno que posteriormente ha demostrado no ser la más apta para la estimulación de los neutrófilos de las analizadas tras los diversos ensayos practicados para producir la máxima liberación de MMP-9. Por tanto tras realizar estudios de la dosis y tiempo idóneos de estimulación de los neutrófilos para obtener la máxima liberación de MMP-9 utilizamos como valores más adecuados para los ensayos realizados un tiempo de incubación de 24 horas y la concentración de alergeno de 40 ¿g/ml y de 20 ¿g/ml de anti-IgE. Estos resultados sugieren que las vías implicadas en la liberación de MMP-9 actúan a través de IgE y alergenos específicos uniéndose a la superficie celular.
Un punto de vital importancia para demostrar que el neutrófilo puede tomar parte activa en la reacción alérgica, ha sido el descubrimiento de que estas células poseían las tres formas conocidas en la actualidad de receptores para la IgE: el heterotrimérico receptor de alta afinidad (Fc¿RI) [46,47], el receptor de baja afinidad para la IgE (Fc¿RII/CD23) [48, 49] y la galectina-3 [50-52].
En algunos de estos trabajos no sólo se ha demostrado la presencia de estos receptores, sino que se ha comprobado que existen rasgos característicos en los pacientes alérgicos.
El número de neutrófilos positivos para la galectina-3, fue similar en los pacientes atópicos que en los controles sanos. Y se ha descubierto como los neutrófilos poseen el mRNA de las tres cadenas de Fc¿IR: Fc¿IR¿, Fc¿IR¿ y Fc¿IR¿. La cadena Fc¿IR¿ no es constitutiva pero si es inducible, por lo que se ha podido comprobar como existen diferencias entre pacientes asmáticos y sujetos sanos. El porcentaje medio de neutrófilos de sangre periférica positivos para el Fc¿RI¿, fue del 70% en enfermos asmáticos comparados con el 4% del grupo de controles sanos. Asimismo, se pudo comprobar como los neutrófilos de los lavados alveolares de los enfermos asmáticos también poseían Fc¿IR¿. Por todo ello se ha especulado que las citoquinas de tipo Th2, como la IL-4 podrían modular positivamente en los neutrófilos de los enfermos asmáticos la presencia del Fc¿IR.
La estimulación de estos receptores induce la activación de los neutrófilos y su degranulación. Teniendo en cuenta estos datos incubamos neutrófilos de pacientes alérgicos con anticuerpos contra los tres tipos de receptores. Los resultados obtenidos demostraban que los tres participaban en la liberación de MMP-9, siendo el anticuerpo contra el receptor Fc¿RII/CD23 el que producía un mayor incremento de la MMP-9 liberada.
5.4. LA MMP-9 LIBERADA DESDE NEUTRÓFILOS ES FUNCIONALMENTE ACTIVA El siguiente objetivo era determinar si la MMP-9 liberada por neutrófilos es funcionalmente activa, es decir, si era capaz de degradar un sustrato como por ejemplo la gelatina. La enzimografía se realizó como previamente hemos descrito obteniéndose los halos de lisis de 92 KDa que demuestran que la MMP-9 secretada por los neutrófilos degradó la gelatina del gel. Estos resultados están en concordancia con otros estudios en los que se llevó a cabo enzimografía con el esputo inducido de pacientes asmáticos asmáticos en la que aparecen las mismas zonas de lisis [35]. Siendo el tamaño de la banda proporcional a la concentración de alergeno o anti-IgE, lo que avalarían los resultados obtenidos en los experimentos anteriores que demuestran que la liberación de MMP-9 por mecanismos dependientes de IgE se produce de forma dosis-dependiente y que la acumulación de MMP-9 era significativamente más elevada después de 18 horas de incubación.
Las conclusiones que obtenemos de este estudio son las siguientes:
1. La provocación ¿in vitro¿ de neutrófilos de pacientes alérgicos con el antígeno responsable del cuadro clínico o con anticuerpos anti-IgE, conduce a un aumento en la liberación de MMP-9. Esta liberación es específica, dosis-dependiente y tiempo-dependiente.
2. La provocación ¿in vitro¿ de neutrófilos de pacientes alérgicos con anticuerpos contra los receptores de IgE Fc¿RI, Fc¿RII/CD23 y galectina-3 provocó un incremento de la MMP-9 liberada.
3. La MMP-9 liberada desde neutrófilos de pacientes alérgicos es biológicamente activa al ser capaz de degradar la gelatina del gel en las enzimografías realidadas.
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