Los receptores Toll-like en la isquemia cerebral

• Autores: David Brea López
• Directores de la Tesis: José Antonio Castillo Sánchez (dir. tes.), Tomas Sobrino Moreiras (codir. tes.), Pedro Ramos Cabrer (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidade de Santiago de Compostela ( España ) en 2010
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Toll like receptors in cerebral ischemia
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Jesús Gómez Reino Carnota (presid.), Francisco Campos Pérez (secret.), Ana María Planas Obradors (voc.), María Ángeles Almeida Parra (voc.), José Manuel Morao Cabral Ferro (voc.)
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  • Tesis en acceso abierto en: MINERVA
• Resumen

  • Las enfermedades cerebrovasculares son consecuencia de una alteración de la circulación cerebral que ocasiona un déficit transitorio o definitivo del funcionamiento de una o varias partes del encéfalo.

    La obstrucción aguda de una de las arterias cerebrales, como por ejemplo la arteria cerebral media (ACM), produce una inmediata reducción del flujo cerebral en el área de irrigación correspondiente (isquemia focal). La reducción del flujo sanguíneo no es homogénea en el sector afectado, y puede cambiar en minutos u horas, especialmente cuando se instaura la reperfusión. La isquemia es grave en el denominado foco isquémico, mientras que en la periferia de éste se establece un anillo denominado área de penumbra, en el cual la disminución del flujo es menos grave, gracias a los aportes sanguíneos de las arterias colaterales del tejido adyacente no isquémico. El impacto de la isquemia cerebral depende de la gravedad y la duración de la reducción del flujo sanguíneo.

    La isquemia desencadena una secuencia de fenómenos moleculares a corto y largo plazo que se inician con el fracaso energético relacionado con la interrupción de los procesos de fosforilación oxidativa y el déficit en la producción de trifosfato de adenosina (ATP). La interrupción de los gradientes iónicos transmembrana debido a fallos en la bomba de sodio-potasio ATPasa y otras bombas iónicas dependientes de ATP son el punto fundamental relacionado con los mecanismos fisiopatológicos de la isquemia y, especialmente, de la muerte celular en el foco isquémico cuando la obstrucción vascular se prolonga durante unos minutos. En todo este proceso se suceden una serie de mecanismos moleculares, muchos de los cuales desembocan en la muerte neuronal. Esta muerte puede suceder de dos maneras. La más común, descrita en los tratados clásicos es la muerte necrótica. Este tipo de muerte es la consecuencia del fracaso energético agudo, con pérdida de la morfología y, finalmente, lisis celular, que desencadena procesos inflamatorios. Por otro lado, puede observarse la muerte apoptótica o muerte celular programada, en la cual se activan mecanismos intracelulares dependientes de energía que llevan a una degradación regulada de la célula, que, más tarde, es eliminada por células fagocíticas sin desencadenar una reacción inflamatoria.

    La muerte celular por necrosis que se produce tras la isquemia cerebral desencadena una respuesta inflamatoria muy intensa que alcanza su máximo varias horas después del inicio del episodio isquémico. Hay muchas evidencias de que la inflamación y la respuesta inmune juegan un papel importante en el pronóstico de los pacientes que han sufrido un ictus.

    La inflamación se caracteriza por la acumulación de células inflamatorias y mediadores en el cerebro isquémico. Los fagocitos periféricos, los linfocitos T, las células NK (del inglés natural killer), y los leucocitos polimorfonucleares, secretan citoquinas que pueden contribuir a la respuesta inflamatoria tras la isquemia cerebral. Los leucocitos procedentes de la sangre periférica y la microglía residente son las células inflamatorias más activadas, que se acumulan en el tejido cerebral tras la isquemia cerebral, conduciendo al daño por inflamación.

    La inflamación es un fenómeno de gran importancia en la fisiopatología de la isquemia cerebral, que conduce al incremento del daño cerebral tras la isquemia. El daño cerebral secundario originado por la inflamación está determinado por el sistema inmune innato y adaptativo. Por tanto, el estudio de éste puede conducir al descubrimiento de nuevas vías terapéuticas anti-inflamatorias a través de la manipulación del sistema inmune.

    El sistema inmune de mamíferos utiliza una serie de mecanismos para detectar y eliminar patógenos invasores, muchos de los cuales requieren la discriminación entre lo propio y lo no-propio. La respuesta inmune se divide en dos componentes distintos: la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. Ambos reconocen microorganismos invasores como no-propios, lo que desencadena la respuesta inmune para eliminarlos. En general, la inmunidad innata, que es altamente conservada en organismos multicelulares, representa la primera línea de defensa contra los patógenos y no requiere la exposición previa del organismo a partículas ajenas para su activación. Los tipos celulares que participan en la inmunidad innata son los macrófagos, neutrófilos, células dendríticas y células NK. La detección de patógenos se basa en el reconocimiento de proteínas altamente conservadas que se expresan en los organismos infecciosos. Por otra parte, la inmunidad adaptativa se activa a través de señales procedentes del sistema inmune innato que inducen la proliferación de linfocitos T y B específicos de antígeno. La respuesta adaptativa es mucho más diversa que la respuesta innata, ya que debe reconocer un número infinito de antígenos. Para ello, cuenta con un complejo sistema de reordenaciones génicas que permiten la expresión de receptores específicos para cualquier antígeno. Así, cada clon de linfocitos T y B expresa un receptor antigénico distinto. A pesar de esta gran diversidad, el sistema inmune adaptativo ha sido muy estudiado, mientras que la respuesta inmune innata es todavía la gran desconocida.

    La respuesta inmune innata no goza de la diversidad de la respuesta adaptativa y debe reconocer los antígenos a través de un grupo de receptores predeterminados. Para ello, estos receptores se han especializado, a lo largo de la evolución, en el reconocimiento de determinadas estructuras altamente conservadas en grandes grupos de microorganismos. Estas estructuras altamente conservadas reciben el nombre de Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMPs, del inglés Pathogen Associated Molecular Pattern) y los receptores del sistema inmune innato que reconocen estas estructuras reciben el nombre de Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRRs, del inglés Pattern Recognition Receptors). Hay un determinado número de receptores clave que reconocen una amplia variedad de PAMPs, entre los que se incluyen los receptores Toll Like (TLR; del inglés Toll-Like Receptors), los receptores NOD-Like (NLR; del inglés NOD-Like Receptors) y los receptores RIG-I-like (RLR; del inglés RIG-I-Like Receptors). Todos estos receptores actúan solos o con la participación de otras moléculas, generando la respuesta inmune innata al reconocer a patógenos invasores. Mientras que los miembros de la familia TLR reconocen bacterias, virus, hongos y protozoos, los NLRs reconocen bacterias y los RLRs virus.

    El receptor original Toll fue descrito en la Drosophila melanogaster y su función referida era la regulación del desarrollo dorsoventral del embrión de la mosca. En 1996, Lemaitre et al se dieron cuenta de que las moscas Toll mutantes eran más susceptibles a las infecciones fúngicas y describieron la función del receptor Toll en la defensa contra las infecciones en la Drosophila, organismo que sólo posee inmunidad innata. Un año más tarde del descubrimiento del papel inmunitario de Toll, se identificaba el primer receptor homólogo en mamíferos, hoy conocido como Toll-Like Receptor 4 (TLR4) cuya activación parecía inducir la expresión de genes que participan en la respuesta inflamatoria. Años más tarde se llevó a cabo la secuenciación del receptor Toll que reveló una gran homología de la región citoplasmática del receptor con el dominio de señalización del receptor de Interleuquina-1 (IL-1) de mamíferos.

    Los TLRs se expresan fundamentalmente en las células del sistema inmune; linfocitos, monocitos, neutrófilos, etc., pero también se expresan en otros tipos celulares como células endoteliales, o la glía. Dentro del CNS existen tres poblaciones fundamentales además de las neuronas: astrocitos y oligodendrocitos, de origen neuroectodérmico, y la microglía que procede del mesodermo. La función principal de la glía es la de proporcionar el soporte necesario para las neuronas. Debido a que existen múltiples infecciones que pueden afectar al CNS y que dichas infecciones están provocadas por bacterias que son capaces de activar a los TLRs, es lógico pensar que las células del CNS deben expresar de forma constitutiva TLRs. De los cuatro tipos celulares que se pueden encontrar en el cerebro, la microglía, célula clave del sistema inmune innato cerebral, expresa todos los TLRs conocidos.

    Por otro lado, los TLRs se expresan en diferentes regiones dentro de la célula. Así, los TLR1, TLR2 y TLR4, y TLR6 se expresan en la superficie celular. Por su parte los TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9 se expresan en compartimentos celulares como los endosomas. La activación de estos últimos requiere la maduración del endosoma.

    Como ya hemos mencionado anteriormente, los TLR se expresan en células del sistema inmune innato y permiten el reconocimiento de determinadas regiones invariables de bacterias, hongos y virus que son esenciales para su supervivencia y están altamente conservados en un amplio espectro de patógenos. En humanos y ratones, se llevan identificados 11 TLRs y al menos un agonista para cada receptor con excepción del TLR10. El TLR1 en combinación con el TLR2 reconoce lipoproteínas, que son constituyentes de la pared celular de muchas bacterias patógenas como por ejemplo Borrellia burgdorferi. El TLR3 reconoce RNA de doble cadena (dsRNA), que se genera durante la replicación de los virus en las células huésped. El TLR4 es el receptor que media la respuesta al lipopolisacárido (LPS) que se encuentra en la pared celular de bacterias gram-negativas. El TLR5 reconoce la flagelina, un monómero del flagelo bacteriano que se extiende desde la pared celular de gram-negativas y sirve a los organismos para moverse en ambientes acuosos. El TLR6 forma heterodímeros con el TLR2 para reconocer lipoproteínas de Mycobacterium. Los TLR7 y 8 median la respuesta a RNA de cadena sencilla rico en regiones GU, que se presenta en células infectadas por virus. El TLR9 reconoce DNAs que contienen altos niveles de CpG no metilados, presentes en bacterias y virus.

    Los TLRs también reconocen ligandos endógenos, capaces de activar estos receptores de la misma forma que lo hacen los ligandos procedentes de agentes infecciosos. El listado de ligandos endógenos publicados se sigue incrementando en la actualidad. Como ejemplo podemos citar el fibrinógeno, la fibronectina, el heparán sulfato, el hialuronano, la HSPs 60 y 70, los ácidos grasos saturados, etc., que son ligandos endógenos de los TLR2 y 4. Hasta el momento no está todavía claro cuál es el papel de los ligandos endógenos de los TLRs en la homeostasis y/o en la enfermedad, sin embargo, se ha sugerido que contribuyen al proceso fisiopatológico de muchas enfermedades autoinmunes o que representan una respuesta fisiológica al daño tisular.

    La activación de los TLRs, desencadenada por la unión de ligandos endógenos o exógenos, activa una vía de señalización que concluye con la activación del factor de transcripción NF-¿B, mediando la expresión de genes pro-inflamatorios y la activación de la inmunidad adaptativa. Como hemos señalado anteriormente, la inflamación contribuye al daño secundario que sucede tras la isquemia cerebral, y estos mecanismos podrían ser TLR dependientes. Por otra parte se ha visto que determinados polimorfismos del TLR4 se asocian con el ictus isquémico, sugiriendo que el TLR4 puede ser un factor de susceptibilidad genética al ictus. Los estudios realizados en modelos animales también apuntan a que los TLRs están implicados en la isquemia cerebral. Estudios en modelos animales de isquemia cerebral llevados a cabo en ratones knock-out observaron un menor volumen de infarto y una mejor puntuación en los test neurológicos en ratones knock-out para el gen del TLR4. Sin embargo, en modelos realizados en ratones knock-out para el TLR2 hay trabajos en los que se demuestra que los ratones knock-out presentaron mayor daño, peor puntuación en las escalas neurológicas y mayor mortalidad que los ratones salvajes, y trabajos en los que se vio que los ratones deficientes en TLR2 desarrollan menor daño que los salvajes en un modelos de isquemia cerebral focal. En estudios clínicos de asociación también se ha visto una correlación en la expresión de TLR2 y TLR4 y el pronóstico de los pacientes con ictus isquémico.

    La necrosis celular que se produce como consecuencia de la isquemia cerebral produce la liberación de una gran cantidad de sustancias que podrían actuar como ligandos endógenos de los TLR. Además, en muchas ocasiones, el infarto cerebral se acompaña de infecciones oportunistas, que a su vez portan ligandos exógenos de los TLRs. La presencia de ambos tipos de ligandos, exógenos y endógenos, debería promover la activación de las vías de los TLRs.

    En este estudio postulamos que la isquemia cerebral induce la liberación de determinadas moléculas, tales como la fibronectina celular, la HSP60 o HSP70 que podrían actuar como ligandos endógenos de los TLR. La interacción de estas proteínas con los TLRs en sangre periférica podría inducir una expresión todavía mayor de dichos TLRs. De este modo, el tamaño del infarto debería reflejarse en la expresión de los TLRs. Así, el análisis de expresión de los TLRs en sangre periférica podría ser un marcador útil del pronóstico de los pacientes con ictus. Además, en este estudio también postulamos que los ligandos presentes en el suero de pacientes con ictus interaccionan con las células del sistema inmune en la circulación periférica, contribuyendo al incremento de la respuesta inflamatoria. El bloqueo de dichos ligandos y/o de los TLRs podría ser una estrategia eficaz para reducir la respuesta inflamatoria.

    En este trabajo hemos llevado a cabo un estudio clínico en el que hemos incluido 110 pacientes con ictus isquémico de menos de 12 horas de evolución. Hemos analizado la expresión de los receptores TLR2, 3, 4, 7, 8 y 9 en células de sangre periférica, así como la presencia de ligandos endógenos en el suero de dichos pacientes (fibronectina celular, HSP60 y HSP70) y la expresión de moléculas inflamatorias (IL-6, IL1ß, TNF-¿, MMP9, VCAM-1, ICAM-1).

    En este estudio hemos encontrado que la expresión de TLR2 y TLR4 a las 24h, 72h y a los 7 días tras la isquemia cerebral, se asocia con el pronóstico funcional de los pacientes a los 3 meses. Además, los pacientes con una mayor NIHSS al ingreso tienen niveles de expresión de TLR2 y TLR4 más elevados. El análisis de asociación entre los TLR2 y 4 y el volumen del infarto reveló una asociación con la expresión de TLR2 y TLR4 a las 72h y a los 7 días.

    Cuando analizamos la expresión de los ligandos endógenos potenciales, fibronectina celular, HSP60 y HSP70, en relación con la expresión de los TLR 2 y 4, sólo encontramos una correlación positiva entre los niveles de fibronectina celular al ingreso y los niveles de TLR2 a las 24h.

    El análisis de la expresión de los TLRs en relación con la expresión de las moléculas inflamatorias demostró una buena correlación de los niveles de expresión de TLR2, TLR4, TLR7 y TLR8 al ingreso con los niveles de IL-1ß, IL6 y TNF-¿ a las 24h, 72h y a los 7 días. Estos resultados indican que los niveles de expresión de TLR2, 4, 7 y 8 al ingreso influyen en la expresión de moléculas inflamatorias en la fase aguda de la isquemia cerebral.

    En resumen, el ictus isquémico provoca la muerte celular del parénquima cerebral. El tejido muerto y el tejido circundante a la isquemia liberan ligandos endógenos de los TLRs. Estos ligandos interaccionan con los TLRs expresados en las células del parénquima cerebral y en las células de sangre periférica. La interacción entre ligandos endógenos y TLRs induce la expresión de moléculas inflamatorias. En este estudio encontramos que los pacientes con infartos más grandes, presentan niveles más elevados de TLRs al ingreso. Además, también los niveles de TLRs, en particular TLR2, TLR4, TLR7 y TLR8, en células de sangre periférica al ingreso correlacionan con moléculas inflamatorias a las 24h, 72h y a los 7 días. La interpretación de estos resultados nos permite hipotetizar que el volumen del infarto determina la cantidad de ligandos endógenos que son liberados. Estos ligandos endógenos inducen la expresión de TLRs en células periféricas. Así, cuantos más ligandos endógenos sean liberados, mayor expresión de TLRs en células periféricas. Los niveles de los TLRs influyen en la expresión de moléculas inflamatorias y como consecuencia en el pronóstico de los pacientes. Por otra parte, también hipotetizamos que, cuando dos infartos cerebrales tienen el mismo tamaño, la misma cantidad de ligandos endógenos son liberados. En este contexto, la expresión de TLRs al ingreso (determinada por otras variables, como por ejemplo variaciones interindividuales) condiciona la respuesta inflamatoria, y como consecuencia el pronóstico de los pacientes.

    Además del estudio clínico, hemos llevado a cabo un estudio in vitro tratando de demostrar que los ligandos endógenos presentes en el suero de pacientes con isquemia cerebral son capaces de activar los TLRs 2 y 4 de células periféricas, y que el bloqueo de estos TLRs y/o de sus ligandos endógenos podría reducir la respuesta inflamatoria. Para ello cultivamos monocitos de sujetos sanos y les añadimos al medio de cultivo suero de los mismos pacientes incluidos en el estudio clínico. La medida de moléculas inflamatorias en el sobrenadante de cultivo reveló que el tratamiento de los monocitos con el suero de pacientes con isquemia cerebral induce una respuesta inflamatoria muy elevada. Cuando estas células fueron pre-tratadas con anticuerpos neutralizantes frente al TLR2 y el TLR4, la respuesta inflamatoria se redujo casi hasta niveles basales, demostrando que la respuesta inflamatoria originada por el tratamiento de las células con suero de pacientes es TLR2/4 dependiente. Pero además, cuando se trató el suero de pacientes con anticuerpos frente a la fibronectina celular y frente a la HSP60, antes de ser añadido al cultivo celular, la respuesta inflamatoria resultó casi inexistente, demostrando que estas moléculas participan en la respuesta inflamatoria que desarrollan los monocitos en cultivo cuando son tratados con suero de pacientes con isquemia cerebral. Estos experimentos fueron replicados en células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC), demostrando los mismos resultados obtenidos con los monocitos en cultivo.

    En conclusión, el presente estudio demuestra que: - Los niveles elevados de TLR2, TLR4, TLR7 y TLR8 en células de sangre periférica predicen el mal pronóstico tras la isquemia cerebral.

    - Los niveles de expresión de TLR4 y TLR8 en células de sangre periférica se correlacionan con el volumen del infarto tras el ictus.

    - Los niveles de expresión de TLR2, TLR4, TLR7 y TLR8 al ingreso influyen en los niveles de moléculas inflamatorias a las 24h, 72h y 7 días tras la isquemia cerebral.

    - El suero de pacientes con ictus induce una respuesta inflamatoria en monocitos y células HUVEC en cultivo que es TLR2/4 dependiente.

    - El suero de pacientes con ictus isquémico incluye la expresión de moléculas, tales como HSP60 y fibronectina celular, que funcionan como ligandos endógenos de los TLR2 y 4.

    - El bloqueo de TLR2 y/o 4 y fibronectina celular o HSP60 reduce la respuesta inflamatoria (inducida por el tratamiento con suero de pacientes con ictus isquémico) de monocitos y células HUVEC en cultivo.