Aislamiento, purificación y caracterización de la enzima tiorredoxina reductasa de hígado de bovino

• Autores: Emilia Martinez Galisteo
• Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 1987
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan López Barea (presid.), Antonio Llobell (secret.), Carlos Gómez-Moreno Calera (voc.), María Carmen Pinto Corraliza (voc.), Germán Soler Grau (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Enzimología
      • Biología molecular
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• Resumen

  • Se ha purificado por primera vez la tiorredoxina reductasa de hígado de bovino hasta 95% de pureza. Se han introducido modificaciones en el ensayo de actividad con dtnb consiguiendo triplicar la sensibilidad del mismo. Se ha caracterizado a la enzima determinando: punto isoeléctrico por cromatoenfoque: 5 5 peso molecular por filtración en gel de sephacryl s-300 y ultracentrifugación por gradiente de sacarosa: 116.000 daltons: constitución de subunidades por page-sds: 2 x 58.000 daltons; radio de stokes por filtracion en gel 42 5 amstrom; coeficiente de sedimentación en gradiente de sacarosa: 6 643; coeficiente de fricción por ultracentrifugación en gradiente de sacarosa 1.319; espectro de absorción uv/visible con tres picos a 277 365 y 460 nm con una relación de a277/a460 de 8; una energía de activación de 9.306 calorias/mol; km para el nadph de 12 5 nm y dtnb 0 2 mm. Se ha inmovilizado la enzima en sepharosa 4b activada para purificar la tiorredoxina homologa por cromatografía de afinidad y se han obtenido anticuerpos anti-tiorredoxina reductasa en los que se ha probado monoespecificidad por inmunoelectroforesis cruzada para cuantificar enzima en extractos crudos y hacer localización celular de la enzima. El único donador de electrones eficaz tanto para la enzima de ternera como para la de e. coli que también se ha caracterizado es el nadph y la enzima de ternera es poco específica en cuanto al disulfuro aceptor de electrones aunque ninguno de los sustratos probados (cde, gssg, coasscoa, coassg, cistina y tiorredoxina oxidada de e. coli) es equiparable al dtnb. la dee. coli por el contrario solo reduce a su tiorredoxina homóloga. La enzima de e. coli y de ternera se inactivan por nadph y se estimulan por oxidación con nadp+ y tiorredoxina oxidada de e. coli. También protege a ambas el edta y piridin nucleotidos oxidados. Se reactivan con tiorredoxina oxidada y nadp+ y la enzima de e. coli también con gssg.