Estudio de NTRC en semillas de cereales
- Autores: María Victoria Armario Nájera
- Directores de la Tesis: Francisco Javier Cejudo Fernández (dir. tes.), María Cruz González García (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Número de páginas: 198
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María Romero Rodríguez (presid.), María Elisa Revilla Torres (secret.), María Dolores Rodríguez Martín (voc.), José Antonio Navarro Carruesco (voc.), Mariam Sahrawy Barragán (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
La NADPH-tiorredoxina reductasa C (NTRC) es una enzima bimodular formada por un dominio NADPH-tiorredoxina reductasa (NTR), en su extremo N-terminal, y un dominio tiorredoxina (Trx), en su extremo C-terminal, que actúa por tanto como un sistema NTR/Trx en un solo polipéptido [1]. Estudios anteriores de nuestro grupo han mostrado que esta enzima tiene localización plastidial [2] y reduce con eficiencia a las 2-Cys peroxirredoxinas [3], sugiriendo su participación en los mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo del cloroplasto. Además, participa en la regulación redox de la ADP-glucosa pirofosforilasa, una enzima clave en la síntesis de almidón, tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos [4]. Por otro lado, estudios anteriores de identificación de dianas de NTRC en endospermo de semillas de cereales sugerían la participación de NTRC en el control redox de diferentes procesos metabólicos que tienen lugar en este importante tejido de las semillas de los cereales, incluyendo la síntesis de almidón y la distribución de azúcares hacia la síntesis de polisacáridos y/o proteínas de reserva.
Basándonos en estos resultados previos, el principal objetivo de este trabajo ha consistido en analizar la participación de NTRC en la regulación redox de la síntesis de almidón en el endospermo de cereales. Para ello, se ha seguido una estrategia basada en la generación de cereales transgénicos con niveles alterados de NTRC en el endospermo, empleando para dicho fin el cereal modelo Brachypodium distachyon. Como paso previo a la generación de las plantas transgénicas, se procedió a actualizar la información disponible en las bases de datos sobre el gen en NtrC, así como, sobre su filogenia.
En primer lugar, los resultados del análisis filogenético han confirmado la presencia del gen NtrC exclusivamente en organismos fotosintéticos. Sin embargo, en contraposición a lo descrito hasta el momento, estos análisis han revelado la existencia de dos copias del gen NtrC, localizadas en distintos cromosomas, en el musgo Physcomitrella y en algunas especies de gran importancia agroeconómica como tomate, patata y soja.
Por otra parte, la clonación del cDNA de NTRC de Brachypodium ha mostrado la existencia de dos tipos de secuencias, una que codificaría para la proteína NTRC completa, mientras que la otra contiene un codón de parada de la traducción prematuro, debido a la retención de 23 pb correspondientes al final del intrón 4. Análisis realizados en mayor profundidad de los eventos de procesamiento que afectan al gen NtrC de Brachypodium, han revelado la existencia de otros fenómenos de procesamiento alternativo, siendo el que afecta al intrón 4 el de mayor relevancia. Se ha demostrado que este evento de splicing es dependiente del tejido analizado, siendo más importante en tejidos no fotosintéticos que en tejidos fotosintéticos y se encuentra conservado en otras especies de plantas con semillas y también en las dos copias del gen en aquellas especies en que está duplicado. También se ha demostrado que existen condiciones ambientales, como el frío y la luz, que alteran la proporción entre los mensajeros alternativo y estándar, asociados a su vez a variaciones en los niveles totales de proteína NTRC, principalmente en tejidos heterotróficos.
Para abordar el objetivo principal de la obtención de plantas transgénicas de Brachypodium con niveles alterados de NTRC en el endospermo, se seleccionó el promotor del gen GLU1 que dirige específicamente la expresión en este tejido. Tras los procesos de transformación y selección de plantas transgénicas, se han seleccionado líneas en las que NTRC está sobre-expresada. Las semillas transgénicas no han mostrado alteraciones significativas en el contenido de almidón. Sin embargo, en la mayoría de las líneas transgénicas generadas se ha observado un ligero aumento en el contenido de β-glucanos, principal polisacárido de reserva de la semilla de Brachypodium. Este incremento da lugar a una disminución significativa de la relación almidón/β-glucanos. Estas semillas transgénicas presentan, además, mayor grado de reducción de γ-gliadinas, aveninas y globulinas 11S, proteínas de reserva mayoritarias en el endospermo de este cereal. Estos resultados sugieren una mayor distribución de los azúcares de la semilla hacia la biosíntesis de β-glucanos. Además, el mayor grado de reducción observado en las proteínas de reserva sugiere que NTRC podría estar regulando su estado redox y, por tanto, su solubilidad.
[1] Serrato et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 43821-43827 [2] Kirchsteiger et al. (2012) Plant Cell 24, 1534-1548 [3] Pérez-Ruiz et al. (2006) Plant Cell 18, 2356-2368 [4] Michalska et al. (2009) PNAS 106, 9908-9913
