Resumen de Desarrollo de un método de diagnóstico de los tumores del estroma gastrointestinal (GIST)
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INTRODUCCIÓN: El término GIST responde a la expresión inglesa “Gastrointestinal Stromal Tumor”.
La mayoría de los GIST se caracterizan molecularmente por presentar mutaciones en CKIT (60-80%) o PDGFRA (5-15%). La distribución y tipo de mutación pueden afectar al grado de la activación constitutiva de la proteína, lo que a su vez genera diferencias en el crecimiento y la agresividad del tumor.
El análisis de la curva de fusión de un fragmento de ADN, mediante lecturas de alta resolución (HRM) se fundamenta en la propiedad de desnaturalización o fusión de la doble hebra de ADN, en condiciones de pH y calor muy concretas. Su aplicación en Biología Molecular ha supuesto un gran avance pues permite caracterizar de una manera más fácil y sencilla diferencias genéticas entre distintas muestras.
OBJETIVO: El análisis de las curvas de fusión por alta resolución puede ser una herramienta óptima para la detección de mutaciones en los tumores del estroma gastrointestinal, al ser una metodología sencilla, rápida, barata y con una altísima sensibilidad. Como tal, podría ser contemplada su implantación en la rutina diagnóstica para la evaluación de dichos tumores.
MATERIAL Y MÉTODOS: Se seleccionaron un total de 50 muestras correspondientes a 50 pacientes previamente diagnosticados de tumor del estroma gastrointestinal (GIST) en el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla entre los años 1993 y 2011 ambos inclusive. De los 50 casos, descartamos 13 debido a discrepancias en el diagnóstico diferido en la nueva revisión diagnóstica o falta de suficiente material genético para el nuevo estudio. Estos 13 casos fueron analizados como un grupo aparte.
Para cada uno de los casos se realizó el siguiente protocolo: 1) Inmunotinción para la expresión de KIT, PDGFRA y DOG1 (marcadores básicos de GIST) 2) Extracción de ADN 3) PCR a tiempo Real y análisis por curvas de fusión de alta resolución (HRM) de los genes CKIT y PDGFRA 4) Secuenciación de los principales exones de los genes en estudio mediante técnica de secuenciación masiva RESULTADOS: El porcentaje total de expresión de CKIT en nuestra serie fue del 97,3%. El estudio inmunohistoquímico de DOG-1 demostró un porcentaje de positividad del 86.5% con un patrón de marcaje similar al de CKIT sin diferencias significativas, mientras que PDGFRA se diferenció significativamente y presento un porcentaje de marcaje muy inferior al resto, del solo 54,1%.
Al igual que se presenta en la literatura científica, el exón 11 de CKIT, presentó una mayor frecuencia de mutaciones (44,8%), con un total de 13 muestras mutadas de 37 casos. Tras el exón 11, el análisis del exón 9 mostró un porcentaje de muestras mutadas del 25%, el exón 13 un 18,8% de mutaciones mientras que para el exón 17 sólo se observó mutaciones en un 11,1% de las muestras analizadas. Respecto a PDGFRA, se encontraron mutaciones del exón 12 en el 26,5% de las muestras. El exón 18, por su parte presentó una tasa de mutaciones del 21,4% Debido a que la secuenciación permite un análisis más detallado del tipo de alteraciones moleculares encontradas, se observó en la serie una gran presencia de polimorfismos de nucleótido simple silenciosos (SNPs). El 81,08% de los pacientes presentó mutación en CKIT o PDGFRA (30/37), de las cuales el 43,24% fueron mutaciones activas (considerándose activa aquellas mutaciones que implican un cambio en la funcionalidad de la proteína) y el 37,84% correspondió a pacientes con SNPs. El 18,92% restante de los pacientes no presentaron alteración alguna en los genes analizados (WT).
Lo más destacable del estudio de secuenciación masiva fue el alto índice de mutaciones silenciosas encontradas. Se describieron 88 SNPs silenciosos en los diferentes exones estudiados de CKIT y PDGFRA. Treinta muestras del total analizadas presentaron una o más sustituciones silenciosas (81,1%). Varias de esas muestras, presentaron a su vez coincidencia con mutaciones activas.
El porcentaje global de concordancia entra el HRM y la secuenciación, no presentó una correspondencia estadística, ya que valorando tanto las mutaciones activas y como las mutaciones silenciosas sólo se encontró una equivalencia máxima del 60%.
CONCLUSIONES 1) Recomendamos la realización de un panel innmunohistoquímico con DOG-1 y CKIT como herramienta para el diagnóstico de los GISTs. El uso de PDGFRA, no resulta fiable para el diagnóstico certero de los GIST.
2) Hemos hallado menor porcentaje de mutaciones en CKIT que lo descrito en la bibliografía En el 81,08% de los tumores estudiados se hallaron mutaciones, de las cuales el 43,24% correspondieron a mutaciones activas y el 37,84% restante a variaciones silenciosas.
3) El alto porcentaje de variaciones silenciosas crea la necesidad de utilizar otra técnica distintas al HRM para el análisis del perfil mutacional de los GIST, ya que esta tecnología no permite discriminar entre mutaciones activas y variación silenciosa.
- English
GIST is the abbreviation for the English term "Gastrointestinal Stromal Tumor" and it is molecularly characterized by mutations in CKIT or PDGFRA.
Mutational analysis was performed by curves high resolution melting (HRM) and sequencing of exons main CKIT and PDGFRA in 50 patients diagnosed with GIST in the HUMV.
In the HRM analysis for CKIT, mutations were found in exon 11 (44.8%), exon 9 (25%), exon 13 (18.8%) and exon 17 (11.1%). In the HRM analysis for PDGFRA, mutations were found in exon 12 (26.5%) and 18 (21.4%).
Sequencing analysis showed a high rate of single nucleotide polymorphisms silent (SNPs). The 81.08% of patients had CKIT or PDGFRA mutation, being 37.84% SNPs.
The low percentage of mutations in CKIT compared with the literature and the high percentage of SNPs reveals that HRM is not recommended for mutational study in GIST.
