Resumen de Variaciones de la secuencia del gen cyp1b1 en glaucoma primario de angulo abierto: mecanismos geneticos de patogenicidad y relación genotipo-fenotipo
El glaucoma es una neuropatía óptica que produce una pérdida progresiva e irreversible de visión como consecuencia de la apoptosis de las células ganglionares de la retina. Constituye la principal causa de ceguera en los países desarrollados. El factor de riesgo más importante es la presión intraocular (PIO) elevada. Existen muchos tipos de glaucoma, el glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) es el más frecuente de todos y clínicamente se caracteriza por un ángulo iridocorneal normal, alteración de la papila óptica y comienzo en edad adulta (>40 años). Desde el punto de vista genético, el GPAA es una enfermedad de herencia compleja.
Actualmente se conocen 4 genes asociados al desarrollo de GPAA: MIOCILINA (MYOC), gen de la PROTEÍNA CON 36 REPETICIONES WD (WDR36), OPTINEURINA (OPTN) y NEUROTROFINA-4 (NTF-4). Los 3 primeros genes fueron inicialmente identificados en casos mendelianos de glaucoma, mientras que el gen NTF-4 fue identificado en casos esporádicos de GPAA. En conjunto, estos 4 genes desempeñan un papel en el 5-12% de los casos no mendelianos de GPAA. Por tanto, los factores genéticos implicados en esta enfermedad permanecen desconocidos en la mayor parte de los casos.
El gen CITOCROMO P450 1B1 (CYP1B1) está localizado en el cromosoma 2p22.2, consta de 3 exones pero sólo el segundo y el tercero son codificantes, dando lugar a una enzima de la superfamilia de los citocromos P450. Se desconoce la función de esta enzima en el ojo pero se ha propuesto que podría metabolizar un compuesto que regula el desarrollo del ángulo iridocorneal. Las mutaciones del gen CYP1B1 causan glaucoma congénito primario (GCP), una forma grave de la enfermedad de herencia autosómica recesiva y que se manifiesta a edades muy tempranas (desde el nacimiento hasta los 3 años de edad). Se han descrito casos familiares en los que coexisten GCP y GPAA. Por estas razones se estimó que CYP1B1 podría ser un gen candidato en glaucoma adulto. Los objetivos principales de este trabajo fueron: a) determinar la asociación del gen CYP1B1 con GPAA, b) estudiar el efecto funcional de las mutaciones identificadas analizando la actividad enzimática y estabilidad de la proteína CYP1B1 y c) analizar la relación genotipofenotipo en los pacientes portadores de mutaciones. Puesto que la PIO elevada es el principal factor de riesgo en GPAA, también se estudió la asociación del gen CYP1B1 con hipertensión ocular (HTO).
La búsqueda y detección de variaciones de la secuencia de CYP1B1 se realizó mediante PCR y secuenciación automática de ADN siguiendo un diseño de casos-controles. Se analizaron un total de 246 pacientes con GPAA, 41 pacientes con HTO y 326 individuos control, todos ellos procedentes de las consultas de oftalmología del complejo hospitalario de Albacete, hospital Arnau de Vilanova de Valencia y hospital Virgen de los Lirios de Alcoy (Alicante). Para el análisis funcional de las variaciones de secuencia, se clonaron las mutaciones y polimorfismos encontrados en los pacientes, se expresaron transitoriamente en células humanas de riñón embrionario (HEK- 293T) en cultivo y se analizó la actividad enzimática y la estabilidad de las proteínas recombinantes.
Se identificaron 10 mutaciones (S28W, G61E, Y81N, Q144H, R145W, G168D, E229K, L240Q, V409F y A443G) en 18 pacientes (7,31%) con GPAA, 3 mutaciones (A189P, A330S y A443G) en 3 pacientes (7,31%) diagnosticados de HTO y 3 mutaciones (P52L, E229K y R368H) en 6 individuos control (1,84%). También se detectó la mutación Y81N en 2 sujetos clasificados como sospechosos de GPAA dadas sus características clínicas. Todas las mutaciones estuvieron presentes en heterocigosis y 8 de ellas (S28W, Q144H, R145W, G168D, A189P, L240Q, A330S y V409F) han sido encontradas por primera vez en este estudio. Las 6 restantes (P52L, G61E, Y81N, E229K, R368H y A443G) habían sido descritas con anterioridad en pacientes con GCP y/o GPAA.
La frecuencia de portadores heterocigotos en GPAA fue significativamente mayor que en controles (p=0,002; OR=4,2; intervalo de confianza=1,55-12,06). La frecuencia de mutaciones de los pacientes con HTO no mostró diferencias significativas frente al grupo control (p=0,135; OR=4,2; intervalo de confianza=0,65- 20,56). Estos datos muestran que las mutaciones en heterocigosis en el gen CYP1B1 están asociadas a GPAA.
Todas las mutaciones identificadas excepto Q144H, predicen cambios no conservadores de aminoácidos y afectan a regiones evolutivamente conservadas de la proteína. Además, todas las mutaciones excepto P52L, Y81N, E229K y R368H, han sido encontradas exclusivamente en pacientes con GPAA o HTO. Por otra parte, el estudio funcional reveló una disminución de la actividad enzimática de la mayoría de las proteínas CYP1B1 mutantes con respecto a la forma silvestre. El ensayo de estabilidad indicó que todas las mutaciones son menos estables que la proteína silvestre. En conjunto, todos estos datos muestran que las mutaciones identificadas son alelos hipomorfos y apoyan su patogenicidad.
Se detectaron también 6 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el gen CYP1B1 (IVS1-13C>T, p.R48G, p.A119S, p.L432V, p.D449D y p.N453S). Se encontraron dos bloques de desequilibrio de ligamiento, uno de ellos formado por los SNPs IVS1-13C>T, R48G y A119S, y el otro por L432V y D449D. Se seleccionaron 2 tagSNPs (A119S, L432V) y el polimorfismo N453S, y se infirieron los haplotipos para cada individuo mediante el programa PowerMarker. El estudio de asociación no mostró diferencias significativas en las frecuencias de los diferentes SNPs ni de los haplotipos analizados entre casos y controles. Sin embargo, 5 haplotipos (RALN, RALS, GSVN, GSLN, GSLS) presentaron una disminución en la actividad enzimática y estabilidad de CYP1B1 con respecto al haplotipo silvestre (RAVN).
Puesto que todas las mutaciones fueron detectadas en heterocigosis, se realizaron coexpresiones transitorias con las formas mutantes y los haplotipos, simulando un modelo celular de expresión en heterocigosis. El análisis de actividad enzimática mostró que la actividad total de CYP1B1 se ajusta a un modelo aditivo en el que ambos alelos (mutante y silvestre) podrían influir en el fenotipo del sujeto.
Además, los resultados indican que, al menos in vitro, el haplotipo del alelo silvestre contribuye de manera significativa a la variación de la actividad enzimática total. Por otra parte, podría existir un rango de actividad enzimática de CYP1B1 (comprendido aproximadamente entre el 35% y 75%) que se asocia con GPAA.
En conclusión, los resultados obtenidos muestran que los alelos hipomorfos del gen CYP1B1 están asociados a glaucoma primario de ángulo abierto y constituyen el principal factor de riesgo genético conocido en el desarrollo de GPAA.
Es el primer estudio de este gen realizado con pacientes españoles afectados de GPAA y uno de los primeros a nivel mundial.
Los datos obtenidos también permiten proponer un mecanismo molecular de la enfermedad en los pacientes glaucomatosos con mutaciones hipomorfas del gen CYP1B1. Estas mutaciones podrían alterar de manera sutil la morfogénesis ocular, especialmente la red trabecular, conduciendo con el paso del tiempo a un aumento progresivo de la presión intraocular y finalmente al desarrollo de glaucoma. Además, dada la variabilidad fenotípica de los pacientes con mutaciones en CYP1B1, se sugiere la existencia de genes modificadores que podrían influir en el fenotipo.
Finalmente, los resultados indican que el GPAA es una enfermedad debida a variantes raras que se ajusta al modelo Enfermedad Común, Variante Rara propuesto para explicar el desarrollo de enfermedades complejas.
