Visualización de interacciones moleculares, dinámica del calcio y topología de proteínas de membrana en células vivas con proteínas fluorescentes
- Autores: Beatriz Domingo Moreno
- Directores de la Tesis: Juan Llopis Borrás (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Gasset (presid.), María del Rosario Sabariegos Jareño (secret.), Sergio E. Padilla (voc.), Francisco Javier Díez Guerra (voc.), Ricardo Sánchez Prieto (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El objetivo general de este trabajo es el diseño y aplicación de construcciones basadas en proteínas fluorescentes para medir diferentes variables fisiológicas y bioquímicas, como son la concentración de Ca2+, interacciones proteína:proteína, y la topología de proteínas de membrana, mediante técnicas de imagen en célula viva.
La sensibilidad del fenómeno FRET a cambios en la distancia entre moléculas fluorescentes en el rango de 1-10 nm, unida a los avances en microscopía y la utilización de las PFs, ha permitido explorar las relaciones íntimas entre moléculas dentro de la célula viva, con preservación de sus funciones y una alta resolución espacial y temporal. Existen muchas maneras de aplicar la técnica de FRET a un determinado problema biológico y las áreas de investigación susceptibles de estudio son innumerables. El éxito dependerá en muchos casos de la elección del diseño experimental y del método de cuantificación apropiados.
La primera parte de este trabajo está dedicada a la valoración de varios métodos de cuantificación de FRET, y en ella se exponen algunos casos prácticos. Mediante la construcción de estándares de FRET compararemos cuantitativamente cuatro de estos métodos: ratio de emisiones, recuperación del donante por fotodestrucción del aceptor, cálculo de emisión sensibilizada por separación espectral, y disminución del tiempo de vida media del estado excitado del donante. Además, se implementará el método de los 3-cubos en ImageJ mediante la generación de macroinstrucciones para automatizar el cálculo de eficiencia de FRET píxel-por-píxel y en pilas de imágenes de gran tamaño. A continuación, se intentará monitorizar interacciones moleculares de carácter dinámico, espacial y temporalmente, mediante FRET: 1) H-RAS:RAF por el método de los 3-cubos en células vivas, y 2) la interacción Grb2:hSpry2 por fotodestrucción del aceptor en células fijadas. Por otra parte, utilizaremos algunos de los estándares mencionados para observar si la eficiencia de FRET, calculada por varios métodos, es dependiente de la concentración de las PFs en el interior de la célula; así mismo, comprobaremos el efecto de la mutación A206K sobre tal dependencia.
En la segunda parte del estudio, estábamos interesados en medir simultáneamente señales de Ca2+ originadas en dos compartimentos celulares distintos utilizando el sensor bioluminiscente aequorina. Para ello se fusionará aequorina con PFs verde o roja, de forma que haya transferencia de energía entre aequorina y la PF, y la emisión procedente de cada compartimento sea de diferente color. Se usarán secuencias apropiadas para dirigir la expresión de las aequorinas quiméricas a varios dominios subcelulares.
En la tercera parte de esta memoria, se propone un método para verificar la topología de proteínas, o dominios de éstas, asociadas a membranas celulares. Se diseñarán una serie de construcciones de orientación conocida para la demostración y calibración del método. A continuación se aplicará el método para revelar la posición de ciertos dominios de dos proteínas asociadas a membrana: una variante truncada del receptor de somatostatina, y una versión de GPBP de 91 KDa, iniciada por traducción no canónica del ARNm. Del mismo modo, cuantificaremos la proporción de isoformas de la proteína priónica (PrPC) generadas a partir de la introducción de varias mutaciones en su secuencia.
