Resumen de Organization of phage phi29 dna replication: Role of protein p16.7
ORGANIZATION OF PHAGE PHI29 DNA REPLICATION: ROLE OF PROTEIN P16.7 Se conoce poco sobre la organización in vivo de la replicación del ADN procariótico asociada a la membrana. En la presente tesis, se ha estudiado este proceso fundamental utilizando el fago phi29 (cuyo hospedador es Bacillus subtilis) como sistema modelo. La proteína de membrana p16.7, codificada por el fago phi29, es una de las pocas proteínas conocidas que está implicada en la asociación de la replicación del ADN en la membrana. Los resultados obtenidos mostraron que p16.7 es una proteína modular compuesta por tres dominios independientes; un dominio transmembrana N-terminal, un dominio intermedio "coiled-coil" y un dominio funcional C-terminal que es responsable de la dimerización, de la oligomerización y de la unión al ADN y a la proteína terminal por parte de la proteína. Aunque la estructura secundaria del domino funcional de p16.7, p16.7C. es muy similar a la de los homeodominios eucarióticos de unión al ADN, sus estructuras terciarias son fundamentalmente diferentes, La resolución de la estructura tridimensional de p16.7C por medio de técnicas de RMN y de rayos-X reveló que p16.7C forma un nuevo tipo de plegamiento dimérico de seis hélices. Además, la estructura cristalina de p16.7C en complejo con el ADN de cadena doble determinó los modos de oligomerización y de unión al ADN, proporcionando un mayor conocimiento en la organización del genoma del fago en la membrana de la célula infectada. Así, tres dímeros de p16.7C se ordenan cara a cara formando una cavidad profunda en la que se une el ADN. Este ordenamiento constituye una unidad funcional de unión al ADN. La estructura de p16,7C permitió la identificación de residuos y de regiones susceptibles de estar implicadas en la dimerización de p16.7C y en la funcionalidad. Se utilizaron mutantes puntuales y de deleción para poder determinar estas predicciones. Estos estudios mostraron que tanto el Trp-116 como la extensión C-terminal (residuos 122-130) de p16.7C son cruciales para su dimerización y funcionalidad. El aminoácido Trp-116 forma parte de un nuevo tipo de caja aromática de dimerización que hemos denominado "caja de prolinas". Mientras que el residuo Asn-120 juega un papel minoritario en la dimerización de p16.7C, resulta esencial para la oligomerización y la unión al ADN, proporcionando así una evidencia de que la oligomerización y la unión al ADN por parte de p16.7C son procesos que están acoplados, Finalmente, se estudió la localización in vivo de varios componentes de la maquinaria de replicación del fago phi29 por medio de técnicas de microscopía de fluorescencia. De esta forma, se determinó que p16.7, el ADN genómico y la ADN polimerasa de phi29 tienen una distribución helicoidal en células infectadas de B. subtilis. Interesantemente, la distribución helicoidal de p16.7, el ADN genómico y la ADN polimerasa de phi29 es dependiente de las proteínas citoesqueléticas MreB, Mbl y MreBH de B. subtilis. Además, la replicación del ADN del fago phi29 se vio severamente afectada en células mutantes para estas proteínas del citoesqueleto. En conjunto, estos resultados indican fuertemente que el citoesqueleto bacteriano sirve de andamio para la organización de la replicación del fago phi29 asociada a la membrana. Además, los resultados son compatibles con un modelo en el que p16.7 forma parte de un complejo que conecta el ADN de phi29 con el citoesqueleto bacteriano.
