Resumen de Generacion y analisis fenotipico de ratones dko p21-/-53-/- en fondo c57bl/6j. La importancia de p21cip1 en el desarrollo de linfomas t
Índice Prólogo 1 Abreviaturas más utilizadas 3 1. Introducción 1.1. El cáncer 0 5 El ciclo de división celular 5 El cáncer 8 Tipos de cáncer 9 Neoplasias del sistema hematopoyético 10 Neoplasias del sistema hematopoyético en el ratón 11 El timo. Linfomas tímicos 13 1.2. Modelos animales para el estudio del cáncer 16 Modelos animales 16 Importancia del fondo genético en modelos de ratón 18 Modelos de ratón mutantes para Trp53 20 Modelos de ratón mutantes para p21Cip1 22 Modelos de ratón para el estudio de linfomas tímicos 22 1.3. p53 y p21Cip1: su vía de supresión tumoral 25 El supresor de tumores Trp53 25 Funciones de p53 25 La proteína p21Cip1 30 Funciones de p21Cip1 31 Generación y análisis fenotípico de ratones dKO p21-/-p53-/- en fondo C57BL/6J. La importancia de p21Cip1 en el desarrollo de linfomas T 7 Regulación de la expresión de p21Cip1 36 Interacción con otras vías de supresión tumoral 39 2. Objetivos 2.1. Antecedentes e hipótesis 43 2.2. Objetivos 44 3. Materiales y métodos 3.1. Modelos animales 47 3.1.1. Ratones nulos para p21Cip1 47 3.1.2. Ratones nulos para Trp53 47 3.1.3. Ratones nulos para p21Cip1 y Trp53 47 3.2. Análisis genético 48 3.2.1. Extracción de ADN 48 3.2.2. Determinación genotípica del alelo p21Cip1 49 3.2.3. Determinación genotípica del alelo Trp53 50 3.2.4. Condiciones de la reacción de amplificación 50 3.2.5. Análisis electroforético 51 3.3. Estudios in vivo 51 3.3.1. Manejo y control de los ratones 51 3.3.2. Determinación del punto final y toma de muestras 52 3.3.3. Caracterización fenotípica 53 Generación y análisis fenotípico de ratones dKO p21-/-p53-/- en fondo C57BL/6J. La importancia de p21Cip1 en el desarrollo de linfomas T 8 3.4. Estudio histopatológico 54 3.4.1. Caracterización histopatológica e iconografía 54 3.4.2. Técnicas inmunohistoquímicas 54 3.4.3. Anticuerpos utilizados 56 3.5. Estudios in vitro (MEFs) 57 3.5.1. Fibroblastos embrionarios murinos (MEFs) 57 3.5.2. Tratamientos con radiación ¿ 58 3.5.3. Medida de la proliferación celular in vitro 58 3.5.4. Proliferación celular sin adhesión a sustrato 58 3.5.5. Ensayo de formación de colonias 59 3.5.6. Formación de tumores en transplantes in vivo 60 3.5.7. Inestabilidad cromosómica en MEFs 60 3.6. Análisis de proteínas 61 3.6.1. Extracción de proteínas 61 3.6.2. Cuantificación de proteínas 62 3.6.3. Western blot 62 3.7. Evaluación de los niveles de apoptosis 63 3.7.1. Cuantificación de Caspasa 3 63 3.7.2. PARP proteolizada 63 3.8. Respuesta aguda a radiación ¿ en timocitos 64 3.9. Tratamientos con radiación ¿ en ratones 64 3.10. Análisis estadístico 65 Generación y análisis fenotípico de ratones dKO p21-/-p53-/- en fondo C57BL/6J. La importancia de p21Cip1 en el desarrollo de linfomas T 9 4. Resultados 4.1. Caracterización fenotípica y fondos genéticos 68 4.1.1. Viabilidad de los mutantes estudiados 68 4.1.2. Diferencias en mortalidad embrionaria 69 4.1.3. Causas de mortalidad embrionaria 71 4.2. Supervivencia y causas de mortalidad post-natal 73 4.2.1. Causas de mortalidad en ratones mutantes para p21Cip1 73 4.2.2. Causas de mortalidad en ratones mutantes para Trp53 75 4.2.3. Causas de mortalidad en ratones dobles mutantes 76 4.2.4. Curvas de supervivencia y períodos de latencia tumoral 76 4.3. Espectro tumoral e histopatología 81 4.3.1. Espectro tumoral de los distintos mutantes 81 4.3.2. Incidencia de linfomas 87 4.3.3. Incidencia de sarcomas 89 4.3.4. Características patológicas de los tumores 89 4.4. p21Cip1 y respuesta a radiación ¿ 91 4.4.1. Inducción de linfomas tímicos por radiación ¿ 91 4.4.2. Respuesta aguda a radiación ¿ 93 4.5. Expresión de p21Cip1, apoptosis y linfomas tímicos 94 4.5.1. Expresión de p21Cip1 en linfomas de ratones C57BL/6J 94 4.5.2. Expresión de p21Cip1 en tumores nulos para Trp53 95 4.5.3. Niveles de apoptosis en linfomas tímicos 96 4.5.4. Índices de proliferación en linfomas tímicos 98 Generación y análisis fenotípico de ratones dKO p21-/-p53-/- en fondo C57BL/6J. La importancia de p21Cip1 en el desarrollo de linfomas T 10 4.5.5. p21Cip1 y latencias en aparición de linfomas 98 4.6. Ensayos con fibroblastos embrionarios 100 4.6.1. Duplicaciones de población celular en cultivo 100 4.6.2. Formación de colonias y crecimiento en soft-agar 101 4.6.3. Desarrollo de tumores en ensayos alogénicos 102 4.6.4. Irradiación e inestabilidad cromosómica 103 4.6.5. Respuesta a irradiación en MEFs 106 5. Discusión 109 6. Conclusiones 129 7. Bibliografía 132 8. Publicaciones 142
