Resumen de Desarrollo de nuevas herramientas y protocolos de selección de enzimas termoestables en thermus thermophilus
El género Thermus se ha convertido en uno de los modelos más utilizados entre las bacterias termófilas debido a su fácil manejo, en el laboratorio, debido a que los cultivos de este microorganismo crecen bajo condiciones aeróbicas y gracias a su competencia natural. Estas propiedades y la habilidad der sus enzimas termófilas y complejos supramoleculares de cristalizar a temperatura ambiente, se encuentran entre los mayores logros en los últimos años en el campo de la biología estructural, con ejemplos tan relevantes como las estructuras de alta resolución del ribosoma 70S, la RNA polimerasa bacteriana y el complejo respiratorio I.
Para establecer un vínculo claro entre estructura y función se requieren herramientas genéticas bien desarrolladas, y en esta Tesis Doctoral tratamos de incluir algunos de los más recientes intentos de proporcionar nuevas herramientas para el análisis genético de Thermus. Cuando comenzamos este trabajo, sólo podía utilizarse una única resistencia a antibiótico (kanamicina) como marcador de selección a altas temperaturas, y cualquier manipulación posterior de las cepas requeriría la deleción del marcador para poder ser utilizada de nuevo en la misma cepa. Para sobreponernos a ello, tratamos de utilizar marcadores de selección alternativos.
Para ello, seguimos dos estrategias. Por un lado, a partir del desarrollo de una forma termoestable de la higromicina B fosfotransferasa por parte de un grupo japonés (Nakamura, 2005), generamos nuevos plásmidos compatibles con la resistencia a kanamicina, lo que permite los ensayos de expresión y complementación en fondos resistentes a kanamicina.
Por otro lado, describimos el desarrollo de un nuevo marcador basado en un alelo mutante espontáneo del gen rpsL que codifica una proteína mutante S12, que confiere dependencia de Estreptomicina. Así, este marcador, permitió su uso no solo para la construcción de nuevos vectores, sino también para llevar a cabo la deleción dirigidas de genes utilizando su selección negativa.
Otro objetivo está dedicado al uso de una forma mutante de la GFP ("Green Fluorescent Protein", Proteína Verde Fluorescente) de Aequorea Victoria como marcador de localización en T. thermophilus. Demostramos que una forma mutante de esta proteína puede ser expresada y procesada en T. thermophilius a 70º C para dar una proteína fluorescente, cuya utilidad queda demostrada expresando proteínas citoplásmicas y periplásmicas como fusiones en N-terminal de esta variante de GFP.
Por último, desarrollamos un método nuevo y general de estabilización de proteínas a través de un protocolo de selección en Thermus thermophilus, en colaboración con una compañía de biotecnología especializada en evolución de proteínas. El método está basado en la interferencia en el plegamiento que la zona N-terminal de una proteína tiene sobre el extremo C-terminal. Para ello, desarrollamos plásmidos desde los cuales se pudieran expresar fusiones entre proteínas de interés y un reportero en T. thermophilus a temperaturas termófilas. Con esta estrategia pudimos demostrar este principio y seleccionamos formas termoestables del interferón gamma humano, una proteína que no tiene actividad enzimática, con un protocolo muy rápido y eficiente. La aplicación general de este método a otras proteínas y enzimas ha sido demostrado más adelante en la compañía de biotecnología con la que colaboramos.
