Resumen de Diseño de un sistema no genotóxico para activar la respuesta al daño en el adn
Índice ABREVIATURAS................................................................................................1 ABSTRACT .........................................................................................................3 INTRODUCCIÓN...............................................................................................7 1. Fuentes y tipos de daño en el ADN.................................................................................. 8 2. La respuesta al daño en el ADN ..................................................................................... 10 3. Iniciación de la señal: PIKKs ......................................................................................... 12 3.1. DNA-PKcs ............................................................................................................................. 14 3.2. ATM....................................................................................................................................... 15 3.3. ATR........................................................................................................................................ 16 3.4. Cooperación entre ATM, ATR y DNA-PKcs ................................................................... 19 4. Amplificación de la señal ............................................................................................... 20 5. Efectos de la respuesta al daño en el ADN..................................................................... 23 5.1. Reparación ............................................................................................................................. 24 5.2. Apoptosis ............................................................................................................................... 26 5.3. Control del ciclo celular ....................................................................................................... 27 5.3.1. El ciclo celular .............................................................................................................................. 27 5.3.2. Control transitorio del ciclo: checkpoints................................................................................ 31 5.3.3. Parada permamente del ciclo: senescencia .............................................................................. 34 6. La DDR como mecanismo de supresión tumoral ......................................................... 36 OBJETIVOS.......................................................................................................43 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................47 1. Clonaje...................................................................................................................................... 47 2. Cultivo celular .......................................................................................................................... 47 3. Infecciones y obtención de clones ......................................................................................... 48 4. Inmunofluorescencia HTM.................................................................................................... 48 5. Western Blotting ...................................................................................................................... 50 6. RNAi ......................................................................................................................................... 51 7. Checkpoints, proliferación y senescencia............................................................................. 51 8. Ensayo de cometa..................................................................................................................... 52 9. Southern Blotting..................................................................................................................... 52 RESULTADOS...................................................................................................57 1. Generación de un sistema inducible para la activación de de la DDR ......................... 57 1.1. Fundamento de la activación ectópica de ATR ................................................................ 57 1.2. Diseño de un sistema inducible .......................................................................................... 58 2. Caracterización y funcionamiento del sistema en células primarias de mamífero...... 59 2.1. Activación de ATR por la acción de la quimera TADER .................................................. 61 2.2. La quimera TADER activa específicamente a ATR en respuesta a 4OHT...................... 63 2.3. La activación de ATR se produce en ausencia de daño en el ADN ............................... 64 2.4. La activación de ATR es capaz de inducir checkpoint en MEF...................................... 67 2.5. El checkpoint G1/S inducido por ATR depende de p53 pero no de ATM................... 68 2.6. El checkpoint permanente detiene la proliferación celular en MEF.............................. 70 2.7. La actividad persistente de ATR provoca la entrada en senescencia. ............................ 71 2.8. ATR induce senescencia no asociada a daño en el ADN ................................................ 72 2.9. La senescencia inducida por ATR es dependiente de p53, pero no de p19ARF.............. 73 3. Expresión del sistema en líneas inmortales................................................................... 74 3.1. ATR fosforila múltiples substratos en líneas inmortales................................................. 75 3.2. La fosforilación de substratos provocada por TADER necesita RPA, Rad9 y ATRIP .. 76 3.3. La activación ectópica de ATR no es suficiente para ubiquitinar FANCD2 ................ 77 3.4. Inducción de efectores del arresto en G1 por la actividad de ATR................................ 78 3.5. Inducción del checkpoint G1/S por actividad de ATR en G1 ........................................ 79 3.6. El sistema TADER activa un checkpoint en G2 a través de Chk1.................................... 82 3.7. La señalización persistente de ATR detiene la proliferación e induce senescencia en NIH3T3 y MCF-7......................................................................................................................... 83 3.8. La senescencia en la línea humana MCF7 viene acompañada de la activación de Rb y la aparición de SAHF................................................................................................................... 84 4. Expresión del sistema en un modelo animal ................................................................. 86 5. Aplicaciones del sistema de activación artificial de ATR.............................................. 91 5.1. ¿Puede utilizarse el sistema basado en TAD para estimular la reparación de DSB? ... 92 5.1.1. La fosforilación deslocalizada de H2AX no influye en la formación de focos................... 93 5.1.2. EL sistema TADER estimula la reparación de DSB.................................................................. 95 5.1.3. La activación de ATR por TADER estimula la reparación en células carentes de ATM..... 97 5.2. ¿Es la senescencia reversible? .............................................................................................. 98 5.2.1. El sistema TADER no es funcionalmente reversible .............................................................. 99 5.2.2. Desarrollo de un sistema inducible y reversible....................................................................100 5.2.3. Evidencias sobre la no reversibilidad de la senescencia .......................................................103 5.3. ¿Puede utilizarse ATR como diana terapéutica contra el cáncer?................................ 106 5.3.1. Diseño de un screening de inhibidores de ATR.....................................................................107 5.3.2. Identificación de inhibidores potenciales de ATR................................................................110
