Estudio estructural y funcional del arnp del virus de la gripe

• Autores: Rocío Coloma Ciudad
• Directores de la Tesis: Jaime Martín-Benito Romero (dir. tes.), Juan Ortín Montón (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2009
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Antonio García Alvarez (presid.), José María Almendral del Río (secret.), Pilar Pérez (voc.), Óscar Antonio Llorca Blanco (voc.), José Francisco Parra Fernández (voc.), Mauricio García Mateu (voc.), José Antonio Melero Fondevila (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • SUMMARY 21 INTRODUCCIÓN 23 El Virus de la Gripe 25 1. Historia 2. Clasificación y Nomenclatura 3. La partícula viral - Proteínas Virales 4. RNAs virales La Ribonucleoproteína del Virus de la Gripe 29 1. La polimerasa viral - PB PB 1 - PB PB 2 - PA PA 2. La nucleoproteína Ciclo de Infección Viral 35 1. Entrada de las partículas Virales 2 . Transcripción, replicación y expresión génica 3 . Procesamiento de los RNAs virales y síntesis de proteínas 4 . Formación y salida de nuevas partículas virales Procesos de Replicación y Transcripción del Virus de la Gripe 38 1. Transcripción viral 2 . Replicación viral Factores Celulares asociados a las RNPs 40 Estudio Estructural de Maquinarias de Replicación 41 1. Abordajes tridimensionales 2 . Requerimientos 3 . De la Observación al microscopio a la obtención de un m odelo 3D - El procesamiento de la imagen - A nálisis bidimensional - R econstrucción tridimensional de partículas in dividuales OBJETIVOS 47 MATERIALES Y MÉTODOS 51 Materiales 53 1 . Líneas Celulares 2 . Bacterias 3 . Virus 4 . Plásmidos 5 . Anticuerpos 6 . Resinas de Cromatografía Métodos 53 Manipulación del DNA y Clonajes 1. Construcción del plásmido pCMV CMV PB PB 2-HIS IS 2 . Construcción del plásmido pHH clon 23 3 . Mutantes de NP NP Generación y Titulación de vTF7-3 1. Generación de stocks de virus 2 . Titulación mediante ensayo en placa Manipulación de cultivos celulares 1. Reconstitución de RNP RNP RNP s in vivo 1.1 Para análisis estructural 1.2 Para ensayos de complementación 2. Reconstitución de polimerasa in vivo 3 . Expresión de nucleoproteína 4 . Obtención de extractos celulares Purificación de RNPs Paso1. Purificación de RNP RNP RNP s por cromatografía de a finidad P P P aso 2. Purificación de RNP RNP RNP s por cromatografía de e xclusión molecular P P P aso 3. Concentración de RNP RNP RNP s por cromatografía d e afinidad Análisis de proteínas 1 . Western Blot 2 . Tinción de geles y membranas 3 . Determinación de proteína CAT CAT CAT 4 . Purificación de oligómeros de nucleoproteína por cromatografía de exclusión molecular Manipulación del RNA 1 . Transcripción in vitro de las RNP RNP RNP s 2 . Digestión controlada del RNA RNA RNA 3 . Marcaje del RNA RNA RNA Microscopía 1 . Tinción negativa 2 . Criomicroscopía electrónica 3 . Digitalización y procesamiento de imágenes 4 . Docking RESULTADOS 63 Determinación de la Estructura Tridimensional de la RNP Recombinante del Virus de la Gripe 65 1. Generación de RNPs recombinantes 1 .1 Reconstitución de RNP RNP RNP s 1.1.1 Líneas celulares, plásmidos y reactivos de transfección 1.1.2 Reconstitución estándar 1 .2 Purificación de RNP RNP RNP s 1.2.1 Selección y optimización de los métodos y tampones de purificación 1.2.2 Purificación estándar 2. Análisis estructural de la RNP recombinante 2 .1 Modelo de la RNP RNP RNP por ME ME de muestras teñidas 2 .2 Estructura de la RNP RNP RNP por criomicroscopía electrónica 2 .3 Localización de las subunidades en la estructura del complejo de la polimerasa 2 .4 Docking de la estructura atómica de la NP NP en el a nillo de NP NP 2 .5 Estudio de la localización del RNA RNA RNA en la RNP RNP RNP del v irus de la gripe Análisis Funcional de la RNP del Virus de la Gripe 76 1. Mutantes de NP en la zona de interacción NP-NP 2 . Mutantes de NP en la zona de interacción NP -polimerasa Análisis Estructural y Funcional del Proceso de Transcripción 81 1. Análisis estructural del proceso de transcripción 2 . Análisis genético del proceso de transcripción DISCUSIÓN 89 1. Análisis estructural de la RNP 91 1.1 La estructura de la RNP 1 .2 El anillo de NP 1 .3 La posición del RNA 1 .4 Estructura de la polimerasa y localización d e los dominios de las subunidades 1 .5 Resumen final de la estructura de la RNP 2. Nuevo Modelo de Transcripción Viral 97 2.1 Estudio del proceso de transcripción 2 .2 ¿Puede una RNP silvestre complementar a otra R NP defectiva en transcripción? 2 .3¿Puede una polimerasa soluble incrementar la tr anscripción de una RNP? 2 .4 Nuevo modelo de transcripción viral 2 .5 El nuevo modelo de transcripción en cis en el c ontexto de la infección viral CONCLUSIONES 105 BIBLIOGRAFÍA 109 ANEXO 131