Producción in vitro de embriones bovinos: efecto de la adicción combinada de los factores de crecimiento egf, igf-i, fgfb y pdgf en los medios de maduración de ovocitos y de cultivo embrionario
- Autores: Adelino Katchicualula
- Directores de la Tesis: María Teresa Carbajo Rueda (dir. tes.), Antonia Fernández Celadilla (codir. tes.), Eugenia Álvarez Álvarez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Gabriel Fernández Álvarez (presid.), Carmen García Díez (secret.), José Antonio García Paloma (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
El propósito principal fue evaluar el desarrollo in vitro de embriones bovinos usando como fuente proteica en los medios de maduración o de cultivo, suero fetal bovino, o utilizando medios libres de suero, implementados con combinaciones de los factores de crecimiento EGF, FGFb, IGF-I y PDGF.
Los ovocitos se aspiraron de folículos entre 2 y 8 mm a partir de ovarios de hembras sacrificadas en matadero. Fueron madurados en TCM-199 implementado con LH, FSH, 17 beta-Estradiol y cisteamina. Este medio de maduración se enriqueció con FCS (10%) o con las mezclas de los factores de crecimiento: EGF (10 ng)+FGFb (20 ng); EGF (10 ng)+IGF-I (5 ng); EGF (10 ng)+PDGF (1 ng); FGFb (20 ng)+IGF-I (5 ng); FGFb (20 ng)+PDGF (1 ng); IGF-I (5 ng)+PDGF (1 ng); EGF (10 ng)+FGFb (20 ng)+IGF-I (5 ng); EGF (10 ng)+FGFb (20 ng)+PDGF (1 ng); EGF (10 ng)+IGF-I (5 ng)+PDGF (1 ng); FGFb (20 ng)+IGF-I (5 ng)+PDGF (1 ng). Los ovocitos madurados fueron fecundados en medio FIV suplementado con BSAfaf. Los presuntos zigotos fueron cultivados durante 9 días (en ambiente humidificado, al 5% de CO2 a 39 ºC) en medio SOFaaci. Este medio de cultivo se complementó, en día 1 o en día 3 postinseminación, con FCS (5%) o con las mezclas de los factores de crecimiento: EGF (10 ng)+FGFb (1 ng); EGF (10 ng)+IGF-I (50 ng); EGF (10 ng)+PDGF (1 ng); FGFb (1 ng)+IGF-I (50 ng); FGFb (1 ng)+PDGF (1 ng); IGF-I (50 ng)+PDGF (1 ng); EGF (10 ng)+FGFb (1 ng)+IGF-I (50 ng); EGF (10 ng)+FGFb (1 ng)+PDGF (1 ng); EGF (10 ng)+IGF-I (05 ng)+PDGF (1 ng); FGFb (1 ng)+IGF-I (50 ng)+PDGF (1 ng).
Los objetivos de estos experimentos fueron: 1. Determinar los efectos en la división y posterior desarrollo embrionario.
2. Definir el momento más adecuado para implementar el medio de maduración o el de cultivo in vitro.
En el experimento 1 se evaluaron los efectos de los factores de crecimiento cuando se utilizaban en el medio de maduración. Ningún tratamiento combinado de los mismos mejoró (p>0,05) los porcentajes de desarrollo embrionario obtenidos cuando se utiliza FCS o cuando se madura sin fuente proteica (Grupo Control).
En el experimento 2 se analizaron los efectos del empleo de los factores de crecimiento en el medio de cultivo. La adición de FCS proporcionó los mejores porcentajes de Blastocistos eclosionados, no pudiendo ser sustituido por ninguna de las combinaciones de factores de crecimiento. Por otra parte, tanto la adición de FCS como de las asociaciones de factores de crecimiento, resultó ser más beneficiosa cuando se hizo a partir del día 3 postinseminación, obteniéndose en este caso resultados de eclosión significativamente (p<0,05) más altos que en el Grupo Control con las combinaciones EGF+FGFb; EGF+IGF-I; EGF+PDGF; FGFb+IGF-I; EGF+FGFb+IGF-I; EGF+IGF-I+PDGF.
En el experimento 3 se estudiaron los efectos de los factores de crecimiento cuando se añadían al medio de maduración y de cultivo. Con el medio de maduración no definido complementado con FCS, obtuvieron porcentajes de división embrionaria significativamente mayores (p<0,05) que con el medio definido cuando se enriqueció con las combinaciones de factores de crecimiento. Fueron las asociaciones EGF+FGFb; EGF+IGF-I; EGF+FGFb+IGF-I las que proporcionaron porcentajes de eclosión más altos aunque sin diferencias significativas con el resto de las mezclas ensayadas.
Hemos intentado analizar las acciones sinérgicas de los factores de crecimiento durante el desarrollo preimplantacional de los embriones bovinos. De nuestro estudio se desprende que las asociaciones de factores de crecimiento evaluadas, permitirían el desarrollo de los embriones bovinos hasta blastocistos, pero no aumentarían el potencial de los sistemas in vitro para producirlos. Es posible que el grado de estimulación esté afectado por la dosis y muy probablemente por otros componentes del medio. Nuestros resultados indicarían la existencia de procesos de interferencia, donde la exposición de las células embrionarias a un factor de crecimiento podría comprometer su habilidad para unirse y responder a otro. Aún se requieren estudios adicionales para determinar el papel preciso de estas combinaciones de factores de crecimiento durante la maduración del ovocito y el cultivo del embrión.
