Distribución tisular de los receptores Toll-like (TLR) 3, 7 y 9 en el cerdo y efecto in vitro de la infección por el virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino en su regulación en macrófagos alveolares porcinos

• Autores: Liudmila Kuzemtseva
• Directores de la Tesis: Laila Darwich Soliva (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2012
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Margarita Bofill Soliguer (presid.), Margarita Martín Castillo (secret.), Francisco Javier Domínguez Juncal (voc.)
• Materias:
  • Ciencias agrarias
    • Producción animal
      • Porcinos
    • Ciencias veterinarias
      • Inmunología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • Los receptores Toll-like (TLRs), en particular los que se encuentran en vesículas intracelulares de origen endosomal (TLR3, TLR7 y TLR9), están involucrados en la respuesta innata antivírica. La unión a sus respectivos ligandos conduce a la activación de cascadas intracelulares que resultan en una producción de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-?) y antivirales (interferones de tipo I). Existe muy poca información sobre la distribución celular y tisular de estos receptores en la especie porcina así como su regulación en condiciones normales o de infección. En el primer estudio de la presente tesis se valoró la distribución tisular de los TLRs endosomales en pulmón y tejidos linfoides primarios y secundarios de cerdos sanos de distintas edades. El marcaje del TLR9 se realizó con un anticuerpo comercial con reactividad específica para el porcino. En cambio, en el caso de TLR3 y TLR7 los anticuerpos se dirigían a las moléculas humanas pero, supuestamente, poseían reactividad cruzada con las moléculas de origen porcino. Los resultados obtenidos permitieron valorar la distribución del TLR9 en los distintos tejidos examinados, pero no la de los TLR3 y TLR7 ya que el uso de los anticuerpos dirigidos frente a estos dos últimos receptores no produjo resultados satisfactorios. Así, el marcaje obtenido con el anticuerpo anti-TLR3 fue muy variable en función del tejido utilizado; es decir, en algunos órganos como el pulmón, tonsila o linfonodos parecía ser específico, pero en otros como en el hígado, producía un intenso color de fondo inespecífico. Por el contrario, sí hubo un marcaje específico para el TLR9 que reveló una expresión constitutiva de dicho receptor en células de la periferia de los folículos linfoides de los linfonodos, la tonsila y las placas de Peyer, (células de tipo epitelial, dendríticas, macrófagos o linfocitos) un hecho que sugería que este receptor probablemente puede jugar un papel importante en la activación el sistema inmunitario de los cerdos a partir de las 3 semanas de vida. El segundo estudio de esta tesis consistió en determinar la variación de la expresión de TLR3, TLR7 y TLR9 a lo largo del tiempo en una población de células presentadoras de antígeno. La población de estudio elegida fue la de macrófagos alveolares porcinos (PAMs). Los resultados de la cinética de expresión mediante citometría de flujo nos mostró que estas células presentaban una expresión basal elevada de TLR3 y TLR9 pero no de TLR7. Una de las explicaciones posibles para este marcaje basal señalaría a la necesaria manipulación de estas células antes de ser congeladas como responsable de esta expresión. Por otra parte, es difícil conocer con exactitud el ambiente en el cual se encontraban los PAMs en el pulmón antes de ser recogidos (concentración de interleuquinas, quimioquinas, otras moléculas, etc). Dado que los animales donantes estaban sanos, no presentaban ningún tipo de lesión pulmonar y eran libres de los patógenos víricos comunes del cerdo (circovirus porcino de tipo 2, influenza A y virus del PRRS entre otros) la causa de esta elevada expresión no está clara. En cuanto a la expresión de TLR7, apenas se pudo detectar una expresión basal en los PAMs utilizados. Para el tercer estudio de esta tesis se buscó un modelo de infección con un virus RNA que pudiera influir en la regulación de estos TLRs y además pudiera añadir nuevos conocimientos respecto a la inmunopatogenia de dicha infección. En el campo de las enfermedades infecciosas del porcino, una de las mayores incógnitas inmunológicas del momento la encontramos en la infección con el virus del PRRS. Los resultados de este estudio demostraron que dos cepas del mismo genotipo del virus del PRRS causaban una regulación diferente del TLR3 y del patrón de citoquinas pro-inflamatorias. En concreto, en los estudios de citometría de flujo, la cepa 3262 al inducir la expresión de TLR3 en PAMs, sobre todo a dosis elevadas (m.o.i=1), activaría la producción de TNF-?+; en cambio, la cepa 3267 o la cepa vacunal DV activaron TLR3 con menor intensidad y no inducirían TNF-?; sugiriendo en definitiva, que la regulación del patrón de citoquinas antivirales o pro-inflamatorias en los macrófagos dependería del tipo de cepa utilizada. Resulta interesante señalar que a pesar de las diferencias observadas en la citometría de flujo respecto el porcentaje de células que expresaban TLR3 y en la intensidad de su expresión según el tipo de virus utilizado, la expresión relativa del mRNA no parecía modificarse. Estas diferencias resultan interesantes y apuntan a que distintas cepas de campo de genotipo europeo podrían ejercer un efecto regulador de diferente intensidad sobre moléculas inhibitorias de la cascada de señalización de los TLRs. Además esta regulación parece depender de diferentes factores tales como: la cepa vírica, el tiempo de infección y la dosis infectiva inicial. Nuestros resultados pueden ser útiles para abrir y conducir una nueva línea de investigaciones orientadas hacia el área de la inmunidad innata frente al virus del PRRS.