Resumen de Nous desenvolupaments en glicosintases. Enginyeria i aplicacions
Francesc Xavier Pérez Javierre
La constatació de la rellevància dels carbohidrats i glicoconjugats en processos de reconeixement cel·lular, regulació i senyalització, proliferació cel·lular i resposta immunitària, així com en funcions estructurals i energètiques reconegudes clàssicament, han portat a un interès creixent en aquestes biomolècules per part de la Glicobiologia i la Ciència dels Materials. Aquest fet ha comportat la necessitat de disposar d’eines complementàries o alternatives a la química convencional per a la síntesi d’aquestes biomolècules i abastir-ne així la demanda generada. Tot això ha propiciat el desenvolupament de noves metodologies sintètiques amb la incorporació d’etapes enzimàtiques. L’any 1998 es va desenvolupar la metodologia glicosintasa basada en un redisseny del centre actiu de glicosidases que actuen amb retenció de configuració per tal de suprimir-ne la seva activitat hidrolítica. L’ús d’aquests enzims modificats permeten la catàlisi eficient de la formació d’enllaços glicosídics quan s’empren donadors glicosídics activats amb la configuració anomèrica oposada a la del substrat de la reacció normal d’hidròlisi En la present Tesi s’aprofundeix en la metodologia glicosintasa tant a nivell mecanístic com aplicat. Es treballa amb dues glicosintases, el mutant E134A de la ?-glucanasa de Bacillus lichenisformis i el mutant E383A de ?-glucosidasa d’Streptomyces sp. amb les quals s’assoleixen les següents fites: S’estudia la funció del residu D136 en el centre actiu de la glicosintasa E134A de la ?-glucanasa de Bacillus lichenisformis. L’anàlisi de dobles mutants, mostra que només el mutant E134A/D136E manté certa activitat glicosintasa, suggerint la seva funció com a residu assistent en el mecanisme enzimàtic. També s’obtenen les glicosintases més actives E134S i E134G de la ?-glucanasa de Bacillus licheniformis, on la substitució del E134 per Ser resulta en un enzim amb una activitat glicosintasa incrementada 5 vegades (en termes de kcat/KM) en comparació amb el mutant original E134A. Es demostra la utilitat de la glicosintasa E134A de Bacillus licheniformis per sintetitzar 1,3-1,4-?-glucans artificials per polimerització dels donadors disacàrid (Glc?3Glc?F), trisacàrid (Glc?4Glc?3Glc?F) i tetrasacàrid (Glc?4Glc?4Glc?3Glc?F). S’originen polisacàrids constituïts per unitats repetitives dels seus corresponents monòmers units per enllaços ?-1,4. La morfologia del polisacàrid depèn de la unitat repetitiva que el forma de manera que per (?4Glc?3Glc)n i (?4Glc?4Glc?4Glc?3Glc)n s’obtenen esferulites mentre que per (?4Glc?4Glc?3Glc)n s’obté un precipitat amorf. Aquests polisacàrids constitueixen nous ?-glucans amb estructures homogènies amb una proporció d’enllaços ?-1,3 més elevada respecte els ?-glucans existents a la natura. El grau de polimerització dels ?-glucans obtinguts ve limitat per la solubilitat dels productes de reacció. S’observa que l’ús del mutant més actiu E134S permet estendre la polimerització i assolir polisacàrids d’alt pes molecular en funció de la concentració d’enzim. D’aquesta manera el grau de polimerització (DP) pot ser controlat per l’activitat enzimàtica. Per avaluar la inhibició per producte de l’activitat glicosintasa del mutant E134A se sintetitza l’octasacàrid (?4Glc?4Glc?4Glc?3Glc)2, concloent que el producte de reacció actua com inhibidor competitiu malgrat no té un efecte significatiu en els rendiments preparatius dels productes de polimerització enzimàtica. D’altra banda s’estudia l’activitat glicosintasa del mutant E383A de la ?-glucosidasa d’Streptomyces sp. S’observa que aquest presenta activitat hidrolítica i de transglicosidació, fet que queda palès amb la formació de productes secundaris en la reacció glicosintasa. Descartada que aquesta activitat hidrolítica provingui d’una contaminació d’enzim wt, es proposa un mecanisme d’hidròlisi i transglicosidació assistit per anió fluorur com a nucleòfil exogen per la formació d’aquests productes secundaris no esperats. Finalment s’immobilitza amb èxit la glicosintasa E383A de la ?-glucosidasa d’Streptomyces sp. sobre reïna Chelating Sepharose FF. L’enzim immobilitzat no mostra millora de la seva estabilitat envers els dissolvents orgànics. No obstant, sí millora pel que fa a estabilitat d’emmagatzemament a 4ºC i pH 7 en comparació amb la seva forma lliure i permet la seva reutilització fins a 9 cicles mantenint el 90% de l’activitat inicial.
