Resumen de Study and characterisation of human HEK293 cell line as a platform for recombinant protein production
Leticia Liste Calleja
El present treball es centra en l’estudi de la producció de proteïnes recombinants en línies cel·?lulars de mamífer. Concretament, s’ha realitzat l’estudi de tres estratègies de bioprocés, totes elles basades en el cultiu de cèl·?lules HEK293. Com a proteïna model per a l’expressió de proteïnes heteròlogues s’ha triat la proteïna CapPCV2, la qual conforma la càpsida viral del Circovirus porcí serotip 2 (PCV2). Aquest virus és l’agent causal de PCVDS (porcine circovirus diseases o malaties derivades de circovirus porcí). Aquest terme engloba un conjunt de malalties i síndromes que tenen un elevat impacte econòmic en la indústria porcina. El projecte s’ha enfocat des de la perspectiva de desenvolupament i optimització del bioprocés i, en consequ?ència, l’increment de la producció volumètrica ha estat la força impulsora de tot el treball. En primer lloc es presenten els estudis per a la selecció del medi de cultiu i suplements nutricionals. El creixement cel·?lular depèn en gran mesura de les característiques nutricionals i fisicoquímiques del medi en que se les cultiva. Per tant, trobar el medi adequat és un dels factors clau per a l’expansió del cultiu cel·?lular. L’estudi inicial de medis de cultiu va permetre augmentar sis vegades la densitat de cèl·?lules viables en comparació al medi original en que es cultivaven. D’altra banda, s’han explorat diferents estratègies de cultiu, i com a resultat s’ha implementat una estratègia de fed-?batch que ha permès arribar a densitats cel·?lulars de 26.8x106 cell/mL. En el segon i tercer capítol de resultats, s’avaluen tres estratègies diferents per a la producció de la proteïna recombinant CapPCV2 (r-?CapPCV2). La primera estratègia ha estat la infecció de cèl·?lules HEK293 amb un vector adenoviral que codifica el gen de la CapPCV2 (vector generat dins del treball d’aquesta tesis doctoral). Els paràmetres d’infecció s’han estudiat en profunditat per tal de trobar els paràmetres d’infecció (medi de cultiu, MOI (multiplicitat d’infecció), TOI (temps d’infecció) i TOH (temps de recollida)) per a la millora de la producció de la proteïna i el vector adenoviral. La segona i tercera estratègia estan basades en la generació de línies cel·?lulars estables. Concretament, s’ha generat una línia cel·?lular productora de r-?CapPCV2 a partir de la integració a l’atzar del vector plasmídic en el genoma de la cèl·?lula. D’altra banda, s’han generat línies cel·?lulars amb la integració dirigida del gen en llocs prèviament caracteritzats com d’altra transcripció genètica. La integració dirigida s’ha efectuat mitjançant la tecnologia RMCE (recombinant mediated cassette exchange, o bescanvi de casset mitjançada per recombinació). Després de la comparació de les productivitats específiques i volumètriques aconseguides amb cada estratègia, el millor productor va ser seleccionat. Nogensmenys, r-?CapPCV2 es produeix en quantitats molt baixes i per tant no ha sigut possible dissenyar un procés de producció rentable i altres alternatives de producció s’haurien d’estudiar en un futur. Finalment, l’estudi d’un comportament metabòlic particular observat en les cèl.lules en cultiu s’ha adreçat des d’una perspectiva fisiològica i metabòlica. A certes condicions extracel·?lulars, s’ha observat que les cèl·?lules HEK293 poden consumir de manera simultània glucosa i lactat durant el seu creixement exponencial. Després d’un ampli estudi d’aquestes condicions, s’ha determinat que el canvi de la producció d’àcid làctic (que és el principal problema dels cultius d’alta densitat de cèl·?lules de mamífer) cap al consum d’aquest metabòlit pot ser generat des de el començament del cultiu quan el pH és de 6.6 i la concentració de lactat és de 4-?8mM. En aquestes condicions, ni el creixement cel·?lular ni la producció de proteïna es veuen afectades negativament. A la llum d’aquests resultats, es genera la hipòtesi de que les cèl·?lules HEK293 poden co-?transportar el lactat extracel.lular i els protons com un mecanisme de detoxificació del pH. D’altra banda, l’aplicació de l’anàlisi de balanç de fluxos (FBA) ha revelat que quan la glucosa i el lactat es consumeixen simultàniament s’aconsegueix un metabolisme “equilibrat”, és a dir els fluxos de la glicòlisi i el cicle TCA esdevenen similars, evitant l’acumulació de piruvat en el citosol, la seva transformació a làctic i finalment la secreció d’aquest metabòlit. Aquest comportament és totalment oposat al que s’observa de forma general en els cultius de cèl.lules de mamífer en creixement exponencial, on els elevats fluxos de la glicòlisi troben una limitació en els fluxos d’entrada a la mitocòndria (és a dir, del cicle TCA) i consequ?entment el lactat és produït i secretat al medi. La construcció d’un model metabòlic i l’aplicació de FBA permetrà fer prediccions in silico de comportaments metabòlics causats per la sobreexpressió o el silenciament de gens diana. Aquesta estratègia obre la possibilitat de generar línies cel·?lulars que presentin un metabolisme optimitzat per tal d’estudiar estratègies de cultiu més eficients per a l’increment de la densitat cel·?lular i productivitat de proteïna recombinant.
