Estratègies de diagnòstic genètic en fetus amb malformacions congènites. Correlació genotip-fenotip

• Autores: Irene Mademont Soler
• Directores de la Tesis: Rafael Oliva Virgili (dir. tes.), Aurora Sánchez Díaz (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Alberto Plaja Rubstein (presid.), Anna Goncé Mellgren (secret.), Lluís Armengol Dulcet (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Genética clínica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Las alteraciones cromosómicas constitucionales representan una de las principales causas de anomalías congénitas en la población, y su diagnóstico durante la etapa prenatal es el principal objetivo de la mayoría de procedimientos invasivos que se realizan durante la gestación. Desde la década de los 70, el cariotipo convencional es el gold standard del diagnóstico citogenético prenatal. No obstante, los avances tecnológicos de los últimos años han llevado al desarrollo de técnicas de citogenética molecular que ofrecen unas características muy atractivas, la principal de las cuales es la elevada resolución. En diagnóstico postnatal, las situaciones en que deben aplicarse estas técnicas están bien establecidas, pero el papel que deben jugar durante la etapa prenatal todavía no está bien definido y actualmente está siendo estudiado en profundidad por la comunidad médica y científica. La presente tesis se ha realizado con los objetivos de: i) determinar el potencial diagnóstico y la utilidad del cariotipo y las técnicas de citogenética molecular FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) y CMA (Chromosomal Microarray-based Analysis) en diagnóstico prenatal, especialmente para el estudio de gestaciones con hallazgos ecográficos; y ii) valorar la necesidad de modificación de los procedimientos actuales de diagnóstico citogenético prenatal. En primer lugar se han revisado los resultados de los 29.883 estudios citogenéticos realizados en líquido amniótico durante el período 1998-2009 en el Hospital Clínic de Barcelona. La frecuencia observada de anomalías cromosómicas ha sido del 2,9%, un valor muy similar al obtenido en la revisión más amplia previamente publicada. Las alteraciones cromosómicas más comunes han sido las aneuploidías autosómicas clásicas (48,1%), siendo la trisomía 21 la de mayor incidencia. Para las aneuploidías de los cromosomas sexuales, la más frecuente ha sido la monosomía X (5%); y para las reorganizaciones estructurales, la incidencia de translocaciones e inversiones ha sido del 14,7% y 7,5%, respectivamente. Los resultados obtenidos también destacan que el pliegue nucal incrementado y las anomalías ecográficas son unos indicadores excelentes de anomalía cromosómica. Las anomalías ecográficas han sido la indicación más común para la detección de reorganizaciones cromosómicas desequilibradas y trisomías raras, y este hecho es de gran relevancia, ya que indica que dichas anomalías conllevan manifestaciones clínicas durante la etapa prenatal que son evidentes en la exploración ecográfica. En segundo lugar, se ha evaluado la utilidad de la técnica MLPA subtelomérica para el estudio de gestaciones con hallazgos ecográficos y cariotipo normal. De los 229 fetos analizados, 3 presentaban anomalías cromosómicas subteloméricas crípticas: deleción 14qter, deleción 20pter, y duplicación X/Ypter. Por lo tanto, la frecuencia de desequilibrios subteloméricos submicroscópicos observada ha sido del 1,3%. No obstante, cabe destacar que de las tres anomalías diagnosticadas, las deleciones 14qter y 20pter se consideran clínicamente relevantes, pero la repercusión clínica de la duplicación X/Ypter es incierta. Por otro lado, sólo la deleción 14qter parece poder correlacionarse de forma clara con las anomalías ecográficas diagnosticadas. Estos resultados apuntan a que los hallazgos ecográficos no son los mejores predictores de desequilibrios subteloméricos crípticos clínicamente relevantes durante la etapa prenatal. Además, se han analizado mediante MLPA subtelomérica 5 gestaciones con una anomalía cromosómica visible al cariotipo pero de difícil caracterización por citogenética convencional. En todos los casos la técnica MLPA contribuyó de forma importante a una correcta descripción de la anomalía identificada en un período breve de tiempo (crucial en diagnóstico prenatal), indicando que esta técnica es de gran utilidad para la caracterización de reorganizaciones cromosómicas cuando se utiliza de forma complementaria al cariotipo en diagnóstico prenatal. Por otro lado, con la finalidad de evaluar la utilidad y el alcance diagnóstico de los kits de MLPA comerciales diseñados para el estudio de la región 22q11.2 y otras regiones genómicas previamente asociadas a cardiopatías congénitas, se han estudiado mediante MLPA 4 gestaciones con deleciones de la región 22q11.2 previamente diagnosticadas por FISH, y 55 gestaciones con hallazgos ecográficos cardíacos, cariotipo normal y estudio de FISH negativo para la microdeleción típica de 22q11.2. Los 4 casos con deleciones a 22q11.2 conocidas también se detectaron mediante MLPA, corroborando que ésta es una técnica fiable para el diagnóstico de deleciones de esta región cromosómica. De las 55 gestaciones restantes, se obtuvo resultado del estudio de MLPA en 50, y en ninguna de ellas se detectó un desequilibrio cromosómico. Estos resultados parecen indicar que los desequilibrios cromosómicos de las regiones incluidas en los kits (con la excepción de la región 22q11.2) son poco comunes en fetos con anomalías cardíacas. Estos resultados, junto con el hecho de que la MLPA presenta una tasa de repetición y de no obtención de resultados superiores a la FISH, y que generalmente requiere cultivo celular (lo que retrasa la entrega de resultados), indican que la FISH debería seguir siendo la técnica de elección para el estudio prenatal de fetos con hallazgos cardíacos (frente el MLPA). Finalmente, la última parte de la presente tesis ha consistido en determinar la frecuencia de los diferentes tipos de alteraciones cromosómicas, tanto microscópicas como crípticas, en fetos con hallazgos ecográficos cardíacos. El análisis retrospectivo de los resultados obtenidos en el período 2009-2011 en el Hospital Clínic de Barcelona en este grupo de gestaciones (N=276) ha revelado una frecuencia de anomalías cromosómicas microscópicas y de casos de Síndrome de la deleción cromosómica 22q11.2 del 15,9% y 6,4%, respectivamente. Estos resultados corroboran la fuerte asociación existente entre hallazgos ecográficos cardíacos y anomalías cromosómicas. Además, los resultados obtenidos también indican que esta asociación varía significativamente en función del tipo de alteración ecográfica cardíaca y de la presencia de anomalías extracardíacas. Por otro lado, se han analizado mediante CMA (concretamente array CGH) 51 fetos con hallazgos ecográficos cardíacos, cariotipo normal, y sin estudio o resultado de FISH negativo para la Síndrome de la deleción cromosómica 22q11.2. En este grupo de gestaciones, la tasa de detección de variaciones en número de copia patogénicas ha sido del 2% (1/51), y no se han detectado variantes de significado clínico incierto. También se han realizado estudios de microarray en el único feto de los 276 que presentaba anomalías cardíacas y un reordenamiento cromosómico de novo aparentemente equilibrado. En este caso los estudios de CMA revelaron que el reordenamiento no era realmente equilibrado, y se pudo establecer una correlación genotipo-fenotipo. Si en nuestra serie de 276 gestaciones con hallazgos ecográficos cardíacos se hubiera realizado array CGH en vez de cariotipo, todas las anomalías cromosómicas con repercusión clínica clara diagnosticadas por citogenética convencional, excepto tres triploidías, se habrían podido identificar. Con el fin de diagnosticar las triploidías, y también de evitar la utilización de CMA para la detección de las aneuploidías más comunes, sería recomendable realizar una QF-PCR (Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction) antes de los estudios de microarray. Utilizando la estrategia QF-PCR + CMA (en vez de cariotipo) en nuestras 276 gestaciones, todas las anomalías cromosómicas con repercusión clínica clara diagnosticadas por citogenética convencional y los casos de deleciones de 22q11.2 se podrían haber detectado, y se hubiera incrementado un 2% el número de casos diagnosticados. Por lo tanto, estos resultados muestran el potencial de las plataformas de microarray para el diagnóstico prenatal de fetos con anomalías ecográficas cardíacas. Después de la elaboración de la presente tesis se evidencia la necesidad de un nuevo planteamiento en cuanto a los protocoles clínicos de diagnóstico citogenético prenatal.