Estudio de la respuesta inmunitaria-inflamatoria y oxidativa en pacientes y en un modelo experimental "in vitro" de infección por el virus dengue
- Autores: Alegria Cecilia Levy Guiffrida
- Directores de la Tesis: Melchor Álvarez de Mon Soto (dir. tes.), Nereida Valero Cedeño (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Agustín Albillos Martínez (presid.), Jorge Monserrat Sanz (secret.), María Kiriakidis Longhi (voc.), Juan Manuel Casas Fernández de Tejerina (voc.), Luis Berlanga González (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- español
El dengue es una arbovirosis importante en países tropicales producido por un flavivirus. La infección por virus dengue induce varias alteraciones inmunológicas en el hospedador que podrían estar involucradas en la patogénesis de la enfermedad. No hay información clara acerca del papel de las células monocito/macrófago en la expresión incrementada de mediadores inflamatorios encontrados en infecciones por dengue. El objetivo de este estudio fue evaluar los mediadores inflamatorios de la respuesta inmunitaria en pacientes con infección por dengue y su significancia clínica, haciendo énfasis en la severidad de la enfermedad, el tipo de infección y el serotipo viral infectante. Además, evaluamos el efecto del virus dengue sobre la función y viabilidad de los monocitos infectados experimentalmente con virus dengue y bajo estímulo con LPS, procedentes de sangre de cordón umbilical de neonatos y de sangre periférica de adultos jóvenes y de ancianos. En este sentido, se determinó la concentración de citoquinas proinflamatorias (TNF-[alfa], IL-6 e IL-1[beta]), proteínas del complemento (C3 y C4), proteína C Reactiva (PCR) y oxido nítrico (NO) en 70 pacientes con dengue en fase aguda. Estos pacientes fueron clasificados de acuerdo a la severidad de la enfermedad según los criterios de la OMS en DC y DH, y el tipo de infección en infección primaria (IP) e infección secundaria (IS). El grupo control estuvo conformado por individuos sanos. Los niveles de citoquinas circulantes (TNF-[alfa], IL-6 e IL-1[beta]) y PCR se determinaron por ELISA; C3 y C4 por nefelometría, NO por el método de Griess y MDA por el método del ácido tiobarbitúrico. Se utilizaron los serotipos del virus aislados de los pacientes con dengue y cepas de referencia, los cuales fueron propagados en células de mosquito C6/36 HT, y titulados en células VERO por la Técnica de Plaqueo. En los ensayos in vitro, los cultivos de monocitos fueron cultivados con cepas de referencia del virus y estimulados con LPS por 1 y 3 días post-infección (PI). Se determinaron las citoquinas TNF-[alfa], IL-6 e IL-1[beta], el NO y MDA, utilizando el sobrenadante de los cultivos y catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD) y glutatión reducido (GSH), en lisados celulares. Se determinó apoptosis por TUNEL. Nuestros resultados muestran incremento significativo en las concentraciones de TNF-[alfa] (p<0,001), IL-6 (p<0,001), PCR (p<0,001) y NO (p<0,01) en pacientes con DC y DH y consumo de la proteína del complemento C3 (p<0,01). Estos hallazgos fueron consistentes con la producción incrementada de TNF-[alfa] (p<0,001), IL-6 (p<0,01) y NO (p<0,001) a los días 1 y 3 post-infección en cultivo de monocitos. Los pacientes fueron infectados con los serotipos 2, 3 y 4. El TNF-[alfa] está relacionado con la severidad de la enfermedad, no así con el serotipo viral infectante. Mientras que la IL-6, PCR y C3 se asociaron tanto con la severidad de la enfermedad, y con los serotipos DENV-4, DENV-2 y DENV-3, respectivamente. Existe activación diferencial de los mecanismos antioxidantes de acuerdo a la edad y al serotipo infectante, debido a que la mayor producción fue observada en los monocitos de adultos para CAT y GSH, y de ancianos en el caso de SOD, mientras que los DENV 1 y 4 indujeron la mayor producción. Además, el virus dengue indujo un número incrementado de células apoptóticas al 1er (p<0,0001) y 3er (p<0,0001) día PI en cultivos de monocitos. Estos resultados muestran que la producción incrementada de mediadores inflamatorios, oxidativos y apoptosis en dengue, podría en parte estar mediada por las interacciones virus-monocito y la edad del individuo.
- English
Dengue is an important arboviral disease in tropical countries caused by a flavivirus Dengue virus infection induces several immune disorders in the host that could be involved in the pathogenesis of the disease. It's not has been well established the role of monocyte/macrophage in increased expression of inflammatory mediators found in dengue infections. The aim of this study was to evaluate inflammatory mediators of the immune response in patients with dengue infection and its clinical significance, emphasizing the severity of the disease, the type of infection and the infecting viral serotype. In addition, we evaluated the effect of dengue virus on the function and viability of monocytes experimentally infected with dengue virus and under stimulation with LPS, from umbilical cord blood of newborns and peripheral blood of young adults and the elderly. In this regard, we determined the concentration of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β), complement proteins (C3 and C4), C-reactive protein (CRP) and nitric oxide (NO) in 70 patients with dengue in the acute phase. These patients were classified according to the severity of the disease according to WHO criteria in DF and DHF, and type of infection in primary infection (PI) and secondary infection (SI). The control group consisted of healthy individuals. The levels of circulating cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β) and CRP were determined by ELISA, C3 and C4 by nephelometry, NO by Griess method and MDA by thiobarbituric acid method. We used virus serotypes isolated from patients with dengue and reference strains, which were propagated in C6/36 HT mosquito cells, and counting in VERO cells by the Plaque forming unit technique. Tests conducted in vitro, cultures of monocytes were infected with virus reference strains and stimulated with LPS for 1 and 3 days post-infection (PI). We determined the cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1β, NO and MDA, using the culture supernatants and catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) in cell lysates. Apoptosis was determined by TUNEL. Our results show a significant increase in the concentrations of TNF-α (p <0.001), IL-6 (p <0.001), CRP (p <0.001) and NO (p <0.01) in patients with DF and DHF and consumption of the C3 complement protein (p <0.01). These findings were consistent with an increased production of TNF-α (p <0.001), IL-6 (p <0.01) and NO (p <0.001) at 1 and 3 post-infection days in cultured monocytes. The patients were infected with serotypes 2, 3 and 4 of DENV. TNF-α is related to the severity of the disease, but not with the infecting serotype. While IL-6, CRP and C3 were associated with both the severity of the disease, and DENV-4, DENV-2 and DENV-3 serotypes, respectively. There was a differential activation of antioxidant mechanisms according to the age and the infecting serotype, because the increased production in monocytes from adults to CAT and GSH, and the elderly in the case of SOD, while DENV-1 and 4 induced higher production was observed. In addition, the DENV induced an increased number of apoptotic cells to the 1st (p <0.0001) and 3rd (p <0.0001) days PI in cultured monocytes. These results show that increased production of inflammatory mediators, oxidation and apoptosis in dengue, may be in part mediated by virus-monocyte interactions.
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